Comparative biochemical and pharmacological characterization of the mouse 5HT5A 5-hydroxytryptamine receptor and the human β2-adrenergic receptor produced in the methylotrophic yeast Pichia pastoris
- 作者
- H. Markus WEISS, Winfried HAASE, Hartmut MICHEL, Helmut REILÄNDER
- 单位
- Max-Planck-Institut für Biophysik, Abt. Molekulare Membranbiologie, Frankfurt/M, Germany; Max-Planck-Institut für Biophysik, Abt. Strukturbiologie, Frankfurt/M, Germany
- 杂志
- Biochemical Journal（1998）
- DOI
- 10.1042/bj3301137
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在毕赤酵母中实现小鼠5HT5A血清素受体和人β2-肾上腺素能受体这两种G蛋白偶联受体的高水平功能性表达，并对其进行生化和药理表征。
研究策略
利用毕赤酵母AOX1启动子构建多种表达质粒，将受体基因分别与酿酒酵母α-因子前导肽、c-myc/FLAG标签及生物素化结构域融合；通过筛选多拷贝转化株、使用蛋白酶缺陷菌株（SMD1163）、添加受体配体（alprenolol、育亨宾）等方式优化功能性受体的产量。
核心内容
该研究以甲基营养型毕赤酵母为宿主，系统比较了小鼠5HT5A血清素受体与人β2-肾上腺素能受体两种G蛋白偶联受体的功能性表达。通过AOX1启动子构建表达质粒，将受体基因与α-因子前导肽、c-myc/FLAG标签及生物素化结构域融合，结合多拷贝转化株筛选、蛋白酶缺陷型菌株及配体添加等策略优化产量。结果显示，α-因子前导肽融合使5HT5A受体产量提高3倍，多拷贝基因插入使两种受体产量提高约2倍，添加3 μM alprenolol使β2受体产量提高3倍以上。粗膜制备中5HT5A受体最高约40 pmol/mg膜蛋白，β2受体约25 pmol/mg膜蛋白；摇瓶产量分别为1.5 mg/L和1 mg/L，发酵试验中5HT5A可达12 mg/L。研究发现5HT5A受体因N-糖基化干扰Kex2蛋白酶切割而未被正确加工，β2受体则加工正常。饱和结合实验证实受体药理学特性与哺乳动物细胞表达一致。该工作表明毕赤酵母可高效生产功能性GPCR，产量与杆状病毒系统相当，为受体结构生物学研究提供了可行平台。
创新点
首次系统比较了两种GPCR在毕赤酵母中的表达特性；发现α-因子前导肽融合使5HT5A受体产量提高3倍，多拷贝基因插入使两种受体产量提高2倍；添加alprenolol使β2受体产量提高3倍以上；揭示5HT5A受体因N-糖基化干扰Kex2蛋白酶切割而未被正确加工；证实体内生物素化修饰可作为受体检测与纯化的有效手段。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris KM71 | 甲醇利用途径 | AOX1 | 醇氧化酶1（Aox1） | 催化 | AOX1启动子用于诱导外源基因表达 |
| Pichia pastoris SMD1163 | 甲醇利用途径 | AOX1 | 醇氧化酶1（Aox1） | 催化 | 蛋白酶缺陷型菌株（pep4, prb1），用于减少重组蛋白降解 |
| Pichia pastoris SMD1163 | 血清素信号通路 | 小鼠Htr5a（5HT5A受体基因） | 5HT5A血清素受体 | 调控 | 与α-因子前导肽、c-myc/FLAG标签融合；最高产量约40 pmol/mg膜蛋白；Kex2加工受阻与N-糖基化有关 |
| Pichia pastoris SMD1163 | 肾上腺素信号通路 | 人ADRB2（β2-肾上腺素能受体基因） | β2-肾上腺素能受体 | 调控 | 与α-因子前导肽、FLAG标签及生物素化结构域融合；最高产量约25 pmol/mg膜蛋白；添加alprenolol（3 μM）可提高产量3倍以上 |
| Pichia pastoris SMD1163 | 蛋白质加工（高尔基体） | KEX2 | Kex2内肽酶 | 催化 | 负责切除α-因子前导肽；5HT5A受体因糖基化位阻未被正确加工 |
| Pichia pastoris | 分泌途径 | 酿酒酵母MFα1 | α-因子前导肽（prepropeptide） | 区室化 | 融合至受体N端，提高5HT5A受体产量约3倍 |
关键发现
- 通过α-因子前导肽融合，5HT5A受体产量提高3倍
- 多拷贝基因插入使两种受体产量提高约2倍
- 添加3 μM alprenolol可使β2受体产量提高3倍以上，添加560 μM育亨宾可使5HT5A受体产量提高1.5-2倍。粗膜制备中5HT5A受体最高约40 pmol/mg膜蛋白，β2受体约25 pmol/mg膜蛋白。饱和结合实验测得[3H]LSD的KD为1.9±0.3 nM，[3H]CGP-12177的KD为0.5±0.1 nM。摇瓶培养中，5HT5A受体产量约1.5 mg/L，β2受体约1 mg/L
- 初始发酵试验中5HT5A可达约12 mg/L（细胞密度约200 g/L湿重）。免疫印迹表明5HT5A受体表观分子量比预期高约20 kDa，与N-糖基化和Kex2加工受阻有关
- β2受体则被正确加工且未糖基化。药理学谱与哺乳动物细胞表达结果一致。
研究结论
毕赤酵母表达系统能够高水平生产功能性GPCR，产量与杆状病毒系统相当或更优，且操作简便、易于放大规模，为受体纯化及结构生物学研究提供了充足的原料。