In vivo and in vitro folding of a recombinant metalloenzyme, phosphomannose isomerase
- 作者
- Amanda E. I. Proudfoot, Laurence Goffin, Mark A. Payton, Timothy N. C. Wells, Alain R. Bernard
- 单位
- Glaxo Institute for Molecular Biology, 1228 Plan-les-Ouates, Geneva, Switzerland
- 杂志
- Biochemical Journal（1996）
- DOI
- 10.1042/bj3180437
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
重组金属酶磷酸甘露糖异构酶在大肠杆菌中异源表达时大量形成包涵体，可溶性活性蛋白得率低，需要提高可溶蛋白产量并理解体内外折叠机制。
研究策略
通过提高发酵培养基中锌离子浓度、共表达大肠杆菌分子伴侣GroES/GroEL来增加可溶性PMI比例；并体外复性研究，优化复性条件（还原剂、锌离子、伴侣蛋白），比较可溶性酶与包涵体酶的复性效率。
核心内容
该研究以重组金属酶磷酸甘露糖异构酶（PMI）为对象，针对其在大肠杆菌中异源表达时大量形成包涵体、可溶性活性蛋白得率低的问题，系统考察了体内外折叠条件。在体内层面，将发酵液中锌离子浓度从6 μM提高至1 mM，使可溶性PMI纯化得率从1.37 mg/g cells提高至5.4 mg/g cells，约提升4倍；共表达分子伴侣GroES/GroEL虽使PMI总表达量从总蛋白的30%降至15%，但可溶性PMI比例增加约2倍。在体外复性研究中，最佳条件为DTT 5×10⁻³ M与ZnCl₂ 1×10⁻⁴ M，可恢复30–40%比活；添加2倍摩尔GroEL或60倍摩尔DnaK均可使复性产量再提高2倍，且该辅助作用不依赖ATP。值得注意的是，可溶性重组酶变性后复性可恢复70.3%比活（118.5 units/mg），而包涵体蛋白即使完全单体化后最多仅恢复约21.7%比活（36.6 units/mg），表明包涵体中的PMI部分发生了不可逆变性。研究证实提高锌离子浓度是增加重组金属酶可溶形式的有效策略，并揭示了PMI折叠对金属离子和还原剂的需求以及分子伴侣的非ATP依赖辅助机制。
创新点
发现高浓度锌离子（1 mM vs 6 μM）使可溶性重组PMI产量提高约4倍；共表达GroES/GroEL使可溶性PMI比例增加2倍但总表达量降低；体外复性证明GroEL和DnaK以ATP非依赖方式将复性产量提高2倍；发现包涵体蛋白即使完全单体化后复性产量也远低于可溶性变性蛋白。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli strain B | 磷酸甘露糖异构酶催化的糖代谢途径（甘露糖6-磷酸与果糖6-磷酸互变） | pmi | 磷酸甘露糖异构酶（PMI） | 催化 | 来自白色念珠菌（Candida albicans）的cDNA，在大肠杆菌中重组表达，含锌金属酶 |
| Escherichia coli | 分子伴侣辅助蛋白折叠途径 | groEL | GroEL（Hsp60） | 调控 | 与GroES共表达可增加可溶性PMI；体外复性中ATP非依赖方式提高PMI复性产量 |
| Escherichia coli | 分子伴侣辅助蛋白折叠途径 | groES | GroES（Hsp10） | 调控 | 与GroEL共伴侣，但在体外复性中单独添加无额外效果 |
| Escherichia coli | 分子伴侣辅助蛋白折叠途径 | dnaK | DnaK（Hsp70） | 调控 | 体外复性以60倍摩尔比加入，可提高复性产量2倍，不依赖ATP |
关键发现
- 重组PMI在E.coli中最高表达量达总蛋白的30%，其中90%以包涵体形式存在
- 发酵液中锌离子从6 μM提高到1 mM使可溶PMI比活从11.5 units/mg提高到35 units/mg，纯化得率从1.37 mg/g cells提高到5.4 mg/g cells（约4倍）
- 共表达GroES/GroEL使PMI总表达量从30%降至15%，但可溶性PMI增加约2倍
- 体外复性最佳条件为DTT 5×10^-3 M和ZnCl2 1×10^-4 M，可恢复30-40%比活
- 加入GroEL（2倍摩尔）或DnaK（60倍摩尔）使复性产量再提高2倍，ATP无增强作用
- 可溶性重组酶变性后复性可恢复70.3%比活（118.5 units/mg），而包涵体蛋白最多恢复约21.7%比活（36.6 units/mg）
- 重组PMI含0.7 mol锌/mol蛋白。
研究结论
提高培养基锌离子浓度是增加重组金属酶可溶形式的有效手段；共表达GroES/GroEL可提高可溶比例但降低总表达；PMI体外折叠需要还原剂和锌离子，GroEL和DnaK以ATP非依赖方式协助复性；包涵体蛋白部分不可逆变性，导致复性产量较低。