Purification and reactivation of recombinant Synechococcus phytoene desaturase from an overexpressing strain of Escherichia coli
- 作者
- Paul D. FRASER, Hartmut LINDEN, Gerhard SANDMANN
- 单位
- Lehrstuhl für Physiologie und Biochemie der Pflanzen, Universität Konstanz, W-7750 Konstanz, Germany
- 杂志
- Biochemical Journal（1993）
- DOI
- 10.1042/bj2910687
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从过表达的大肠杆菌菌株中纯化并复性重组 Synechococcus 八氢番茄红素脱饱和酶，以开展酶学表征。
研究策略
将 Synechococcus pds 基因克隆于 pPDSde35 质粒并在大肠杆菌中 IPTG 诱导过表达；利用包涵体分离、8M 尿素溶解、DEAE-纤维素柱层析纯化至均一；通过去除尿素复性，结合偶联酶活测定研究其催化特性、辅因子和脂质需求。
核心内容
该研究从过表达大肠杆菌菌株中纯化并复性重组 Synechococcus 八氢番茄红素脱饱和酶，建立了光合来源脱饱和酶的分离纯化流程。将 pds 基因克隆于 pPDSde35 质粒，经 IPTG 诱导表达后，重组蛋白占细胞总蛋白的5%，通过包涵体分离、8M 尿素溶解和 DEAE-纤维素柱层析，从100 ml培养物中获得4.0 mg均一蛋白，纯化20倍，回收率40%，SDS/PAGE 表观分子量约53 kDa。经去除尿素复性后，酶可催化八氢番茄红素经八氢番茄红素生成ζ-胡萝卜素，产物中约80%为顺式构型。辅因子试验显示 NADP+ 和 NAD+ 分别使活性达12.0%和10.4%，而 FAD 仅5.6%；添加单半乳糖甘油二酯使活性提高至280%，磷脂为212%，双硬脂酸甘油酯为206%。该工作首次获得有活性的光合来源脱饱和酶，确认其依赖 NAD+/NADP+ 和脂质辅因子，为后续酶催化机制研究及除草剂靶点开发奠定了基础。
创新点
首次实现光合来源八氢番茄红素脱饱和酶的分离纯化；建立了从包涵体中高效复性该酶的方法；阐明了 NAD+/NADP+ 作为辅因子而 FAD 无效；发现脂质（特别是单半乳糖甘油二酯和 C18 脂肪酸）显著激活酶活性。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM101 | 类胡萝卜素生物合成 | pds | 八氢番茄红素脱饱和酶 (Phytoene desaturase) | 催化 | 通过质粒pPDSde35过表达重组蛋白，占总细胞蛋白5%，形成包涵体 |
| Phycomyces blakesleeanus C5突变株 | 类胡萝卜素生物合成 | — | — | 催化 | 用于生产[14C]八氢番茄红素底物的偶联菌株 |
关键发现
- 重组蛋白占大肠杆菌总细胞蛋白的5%
- 从100 ml培养物中经20倍纯化获得4.0 mg均一蛋白，回收率40%
- SDS/PAGE表观分子量约53 kDa
- 复性后的酶催化八氢番茄红素经八氢番茄红素（phytofluene）生成ζ-胡萝卜素，ζ-胡萝卜素产物占80%且主要为顺式构型
- 在辅因子试验中，NADP+ 和 NAD+ 分别使活性达12.0%和10.4%，而 FAD 仅为5.6%，NADPH 为4.7%
- 添加单半乳糖甘油二酯使活性提高至280%，磷脂为212%，双硬脂酸甘油酯为206%。
研究结论
成功建立重组 Synechococcus 八氢番茄红素脱饱和酶的纯化与复性流程，获得均一且有活性的酶，确认其催化八氢番茄红素两步脱氢生成ζ-胡萝卜素，需 NAD+/NADP+ 和脂质辅助，为进一步研究脱饱和酶机制及除草剂作用靶点奠定了基础。