Quantitative Transcript Profiling Reveals Down-Regulation of A Sterol Pathway Relevant Gene and Overexpression of Artemisinin Biogenetic Genes in Transgenic Artemisia annua Plants
- 作者
- Rui-Yi Yang, Li-Ling Feng, Xue-Qin Yang, Lu-Lu Yin, Xiao-Ling Xu, Qing-Ping Zeng
- 单位
- Laboratory of Biotechnology, Tropical Medicine Institute, Guangzhou University of Chinese Medicine; Artemisinin Research Center, Guangzhou University of Chinese Medicine
- 杂志
- Planta Med（2008）
- DOI
- 10.1055/s-2008-1081333
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过抑制竞争性的甾醇生物合成通路（鲨烯合酶SS基因），将碳代谢流导向青蒿素生物合成途径，从而提高转基因青蒿的青蒿素产量。
研究策略
利用农杆菌介导的叶盘转化法将反义鲨烯合酶基因(asSS)整合至青蒿基因组，抑制内源SS基因表达；通过实时荧光定量PCR比较转基因植株与野生型中SS、ADS、CYP71AV1、CPR的mRNA水平，并用HPLC测定青蒿素含量。
核心内容
该研究通过农杆菌介导的叶盘转化法，将反义鲨烯合酶基因(asSS)导入青蒿基因组，以抑制竞争性的甾醇生物合成通路，将碳代谢流导向青蒿素合成途径。利用实时荧光定量PCR比较转基因与野生型植株中SS、ADS、CYP71AV1和CPR的mRNA水平，并以HPLC测定青蒿素含量。结果显示，转基因株系T81、T47、T106和T36的SS mRNA分别降至野生型的7.4%、14.9%、13.5%和55.3%；同时ADS、CYP71AV1和CPR的转录水平在多数株系中上调，最高分别达对照的3.38倍、4.4倍和2.5倍。青蒿素含量以T47最高，平均9.909 mg/g DW（单次最高12.8 mg/g DW），显著高于野生型的6.713 mg/g DW，但T106反而降至4.843 mg/g DW。结果表明，抑制鲨烯合酶可协同上调青蒿素生物合成基因并提高产量，但基因表达与产物积累并非完全正相关，仅阻断甾醇分支不足以充分驱动碳流，需结合其他策略进一步促进青蒿素合成。
创新点
采用反义RNA策略下调鲨烯合酶基因表达，首次定量证实SS基因下调与青蒿素生物合成关键酶基因（ADS、CYP71AV1、CPR）上调的协同关系，揭示了代谢分流点调控对青蒿素积累的复杂影响。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua (青蒿) | 甲羟戊酸(MVA)途径 | SS | 鲨烯合酶 (SQS) | 催化 | 催化FPP转化为鲨烯，是甾醇生物合成的关键酶，作为青蒿素途径的竞争分支 |
| Artemisia annua (青蒿) | 青蒿素生物合成途径 | ADS | 紫穗槐二烯合酶 (ADS) | 催化 | 催化FPP环化生成紫穗槐-4,11-二烯，青蒿素生物合成的关键第一步 |
| Artemisia annua (青蒿) | 青蒿素生物合成途径 | CYP71AV1 | 细胞色素P450单加氧酶 (CYP71AV1) | 催化 | 催化紫穗槐二烯连续氧化生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸 |
| Artemisia annua (青蒿) | 青蒿素生物合成途径 | CPR | 细胞色素P450还原酶 (CPR) | 催化 | 为CYP71AV1提供电子，参与氧化还原反应 |
| Artemisia annua (青蒿) | MVA途径 / 甾醇生物合成 | asSS | 无（反义RNA） | 调控 | 反义鲨烯合酶基因，通过转录后沉默抑制内源SS基因表达 |
关键发现
- 转基因株系T81、T47、T106和T36的SS mRNA水平分别降至野生型的7.4%、14.9%、13.5%和55.3%（即降低92.6%、85.1%、86.5%和44.7%）
- ADS mRNA水平在T47、T106、T81中分别为对照的3.38、3.18和1.9倍
- CYP71AV1 mRNA水平在T106、T81、T36、T47中分别为对照的4.4、2.4、1.9和1.02倍
- CPR mRNA水平在T81、T47、T36中分别为对照的2.5、2.3和1.9倍，而T106略低于对照。青蒿素含量以T47最高（平均9.909 mg/g DW，单次最高12.8 mg/g DW），T81为8.337 mg/g DW，T36为7.008 mg/g DW，野生型为6.713 mg/g DW，T106反而降至4.843 mg/g DW。SS mRNA下调与ADS、CYP71AV1、CPR上调并非完全正相关，表明仅抑制甾醇分支不足以充分驱动青蒿素合成。
研究结论
反义SS基因的表达能有效抑制内源SS基因，并协同上调青蒿素生物合成基因ADS、CYP71AV1和CPR，部分转基因株系青蒿素含量显著提高；但青蒿素积累与基因表达水平不完全一致，提示需要结合其他策略（如胁迫诱导）进一步拉动碳流至青蒿素途径。