高级醇 · 代谢工程文献库

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Studies on the nonmevalonate tertene biosynthesis pathway: Metabolic role of IspH (LytB) protein

作者
Felix Rohdich, Stefan Hecht, Katrin Gärtner, Petra Adam, Cornelia Krieger, Sabine Amslinger, Duilio Arigoni, Adelbert Bacher, Wolfgang Eisenreich
单位
Technische Universität München, Lehrstuhl für Organische Chemie und Biochemie, Lichtenbergstraße 4, D-85747 Garching, Germany; Eidgenössische Technische Hochschule-Hönggerberg Chemisches Institut, H307, CH-8093 Zürich, Switzerland
杂志
Proceedings of the National Academy of Sciences（2002）
DOI
10.1073/pnas.032658999
所属领域
代谢工程
关键词
1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphatebiosynthesis of isoprenoidsdimethylallyl diphosphateisopentenyl diphosphate
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解决的核心问题

阐明非甲羟戊酸途径中IspH（LytB）蛋白的代谢功能，即如何将1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸（HMBPP）转化为异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）

研究策略

构建共表达xylB、ispCDEFG和ispH基因的人工操纵子的重组大肠杆菌菌株，外源饲喂[U-13C5]1-脱氧-D-木酮糖，利用NMR波谱分析鉴定代谢产物，确定IspH在非甲羟戊酸途径中的角色

研究路线图

100%
研究问题：阐明IspH（LytB）蛋白在非甲羟戊酸途径中的代谢功能
策略：构建共表达xylB、ispCDEFG、ispH基因的人工操纵子重组大肠杆菌菌株
改造1：构建重组大肠杆菌菌株，共表达xylB和ispCDEFG基因
改造2：外源饲喂[U-13C5]1-脱氧-D-木酮糖，利用NMR检测代谢产物
改造3：IspH蛋白过表达与鉴定（占可溶性蛋白5.6%，分子量36 kDa）
结果1：NMR检测到[U-13C5]IPP和[U-13C5]DMAPP以5:1比例生成
结果2：代谢物定量（MEcPP约25 mM，HMBPP约1 mM，IPP约5 mM，DMAPP约1 mM）
结论：IspH蛋白是催化HMBPP生成IPP和DMAPP的分支酶，填补了MEP途径酶促步骤的最后空白
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核心内容

该研究通过体内实验阐明了非甲羟戊酸（MEP）途径中IspH（LytB）蛋白的代谢功能。研究者在大肠杆菌XL1-Blue中构建了共表达xylB、ispCDEFG和ispH基因的人工操纵子，并将[U-13C5]1-脱氧-D-木酮糖作为底物饲喂重组菌株，随后利用NMR波谱分析鉴定代谢产物。结果显示，IspH蛋白催化1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸（HMBPP）转化为异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP），两者以5:1的比例生成，证明了IspH是MEP途径的分支酶。重组IspH蛋白约占可溶性细胞蛋白的5.6%，分子量为36,161±40 Da。细胞抽提物中检测到约25 mM的2C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸、1 mM的HMBPP、5 mM的IPP和1 mM的DMAPP，同时副产物异戊烯醇随时间积累。该工作填补了MEP途径从丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸到IPP/DMAPP酶促步骤的最后空白，使该途径的酶促步骤全部得以阐明，并提示IspH可作为抗菌和抗疟药物的潜在靶点。

创新点

首次通过体内实验直接证明IspH蛋白催化HMBPP生成IPP和DMAPP（5:1混合物），表明IspH是非甲羟戊酸途径的分支点；填补了该途径从丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸到IPP/DMAPP酶促步骤的最后空白

研究对象（7）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli XL1-Blue 非甲羟戊酸途径（MEP途径） xylB D-木酮糖激酶 催化 将外源1-脱氧-D-木酮糖磷酸化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸
Escherichia coli XL1-Blue 非甲羟戊酸途径（MEP途径） ispC (dxr) 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 催化 催化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化为2C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸
Escherichia coli XL1-Blue 非甲羟戊酸途径（MEP途径） ispD 2C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶 催化 催化2C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸转化为CDP-甲基赤藓醇
Escherichia coli XL1-Blue 非甲羟戊酸途径（MEP途径） ispE 4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 催化 磷酸化CDP-甲基赤藓醇
Escherichia coli XL1-Blue 非甲羟戊酸途径（MEP途径） ispF 2C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶 催化 催化生成2C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸
Escherichia coli XL1-Blue 非甲羟戊酸途径（MEP途径） ispG (gcpE) IspG蛋白 (GcpE) 催化 催化2C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸还原开环生成1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸
Escherichia coli XL1-Blue 非甲羟戊酸途径（MEP途径） ispH (lytB) IspH蛋白 (LytB) 催化 催化1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸转化为IPP和DMAPP（5:1混合物）

关键发现

  1. 重组IspH蛋白占可溶性细胞蛋白约5.6%
  2. 其分子量为36,161±40 Da（预测36,173 Da）。将[U-13C5]1-脱氧-D-木酮糖饲喂给共表达xylB、ispCDEFG和ispH的大肠杆菌菌株后，NMR检测到[U-13C5]IPP和[U-13C5]DMAPP按5:1比例形成
  3. 细胞抽提物中2C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸约25 mM，HMBPP约1 mM，IPP约5 mM，DMAPP约1 mM，另有副产物异戊烯醇随时间增加。推测IspH通过形成双齿反应中间体同时生成IPP和DMAPP。

研究结论

IspH蛋白催化1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸转化为IPP和DMAPP，是非甲羟戊酸途径的分支酶；该途径的酶促步骤已全部阐明。IspH可作为抗菌/抗疟药物靶点。