The deoxyxylulose phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis: Studies on the mechanisms of the reactions catalyzed by IspG and IspH protein
- 作者
- Felix Rohdich, Ferdinand Zepeck, Petra Adam, Stefan Hecht, Johannes Kaiser, Ralf Laupitz, Tobias Gräwert, Sabine Amslinger, Wolfgang Eisenreich, Adelbert Bacher, Duilio Arigoni
- 单位
- Lehrstuhl für Organische Chemie und Biochemie, Technische Universität München, Lichtenbergstrasse 4, D- 85747 Garching, Germany; Laboratorium für Organische Chemie, Eidgenössische Technische Hochschule Zürich HCI, CH- 8093 Zürich, Switzerland
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2003）
- DOI
- 10.1073/pnas.0337742100
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
阐明异戊二烯生物合成的脱氧木酮糖磷酸途径中IspG和IspH蛋白催化反应的具体机制，包括电子供体需求、反应中间体和产物立体化学控制。
研究策略
通过大肠杆菌重组表达并纯化MalE/IspG和MalE/IspH融合蛋白，采用放射性同位素（14C、3H）和13C标记底物，结合反相离子对HPLC和13C NMR检测产物；比较不同电子供体系统（粗细胞提取物、光还原脱氮黄素、黄素氧还蛋白/还原酶/NADPH）对酶活性的激活效果；利用异戊烯基二磷酸异构酶处理产物确定热力学平衡比例；基于实验证据提出自由基/单电子转移反应机理。
核心内容
该研究通过大肠杆菌重组表达并纯化IspG和IspH融合蛋白，利用放射性同位素和13C标记底物结合反相离子对HPLC与13C NMR检测产物，系统阐明了脱氧木酮糖磷酸途径中这两种酶催化反应的机制。研究发现纯化的IspG蛋白单独无活性，需辅助蛋白或光还原脱氮黄素作为电子供体才能催化底物5转化为产物6，速率分别达90 pmol·min⁻¹·mg⁻¹和1 nmol·min⁻¹·mg⁻¹；IspH催化6生成异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）的速率达0.4 μmol·min⁻¹·mg⁻¹，产物比例约6:1，且该比例由动力学控制而非热力学平衡。两种蛋白的紫外-可见光谱在约415 nm处有吸收，提示含[4Fe-4S]²⁺簇。研究表明IspG和IspH是依赖外部电子供体、通过单电子转移和自由基中间体催化的含铁硫簇还原酶，分别经由环氧化物中间体和烯丙基自由基类似Birch还原的机理完成反应，为理解MEP途径的还原步骤提供了关键酶学证据。
创新点
首次证明纯化的重组IspG蛋白需要辅助蛋白（推测为氧化还原穿梭蛋白）才能催化；发现光还原的10-甲基-5-脱氮异咯嗪（脱氮黄素）可同时激活IspG和IspH蛋白，无需预先重建Fe-S簇；通过13C NMR直接证明IspH产物中IPP与DMAPP比例为6:1，且为动力学控制；提出了IspG催化的环氧化物开环还原机理和IspH催化的类似Birch还原的机理。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 脱氧木酮糖磷酸途径 (MEP途径) | ispG (gcpE) | IspG蛋白 | 催化 | 催化2C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸(5)还原开环生成1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸(6)；含[4Fe-4S]簇，需外部电子供体激活 |
| Escherichia coli | 脱氧木酮糖磷酸途径 (MEP途径) | ispH (lytB) | IspH蛋白 | 催化 | 催化6还原生成异戊烯基二磷酸(IPP,7)和二甲烯丙基二磷酸(DMAPP,8)，产物比例约6:1；含[4Fe-4S]簇，可被光还原脱氮黄素或黄素氧还蛋白系统激活 |
| Escherichia coli | 脱氧木酮糖磷酸途径 (MEP途径) | fldA | 黄素氧还蛋白 (Flavodoxin, FldA) | 能量供给 | 与黄素氧还蛋白还原酶和NADPH一起为IspH提供还原当量，速率3 nmol·min^-1·mg^-1 |
| Escherichia coli | 脱氧木酮糖磷酸途径 (MEP途径) | fpr | 黄素氧还蛋白还原酶 (Flavodoxin reductase, Fpr) | 能量供给 | 催化NADPH还原黄素氧还蛋白，参与电子传递链，联合激活IspH |
| Escherichia coli | 异戊二烯生物合成 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 (IdI) | 催化 | 将IPP异构化为DMAPP，用于验证产物比例达到热力学平衡3:7 |
关键发现
- 纯化的MalE/IspG融合蛋白单独无活性，加入ispG缺陷株粗提物后催化5生成6的速率为90 pmol·min^-1·mg^-1
- 在光还原脱氮黄素存在下，IspG催化5生成6的速率为1 nmol·min^-1·mg^-1
- IspH催化6生成IPP和DMAPP的速率达0.4 μmol·min^-1·mg^-1，产物比约6:1
- IspH被黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶/NADPH系统激活时速率约3 nmol·min^-1·mg^-1
- 野生型大肠杆菌粗提物催化5总转化速率约2 pmol·min^-1·mg^-1
- 加入异戊烯基二磷酸异构酶后，IPP/DMAPP比例由6:1变为热力学平衡值3:7。两种蛋白的紫外-可见光谱在约415 nm处有吸收，提示含[4Fe-4S]2+簇。
研究结论
IspG和IspH是含[4Fe-4S]簇的还原酶，依赖外部电子供体通过单电子转移和自由基中间体催化反应；光还原脱氮黄素是有效的通用电子供体；IspH产物IPP:DMAPP比例（6:1）由动力学控制；两种酶的反应机理有相似性，分别经由环氧化物中间体和烯丙基自由基类似Birch还原的过程。