Novel carotenoid cleavage dioxygenase catalyzes the first dedicated step in saffron crocin biosynthesis
- 作者
- Sarah Frusciante, Gianfranco Diretto, Mark Bruno, Paola Ferrante, Marco Pietrella, Alfonso Prado-Cabrero, Angela Rubio-Moraga, Peter Beyer, Lourdes Gomez-Gomez, Salim Al-Babili, Giovanni Giuliano
- 单位
- Italian National Agency for New Technologies, Energy, and Sustainable Development, Casaccia Research Centre; Sapienza, University of Rome; Faculty of Biology, University of Freiburg; Center for Desert Agriculture, Division of Biological and Environmental Science and Engineering, King Abdullah University of Science and Technology; Instituto Botanico, Facultad de Farmacia, Universidad de Castilla-La Mancha
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2014）
- DOI
- 10.1073/pnas.1404629111
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析藏红花（Crocus sativus）柱头中藏红花素（crocin）生物合成的第一个关键酶，即催化玉米黄质（zeaxanthin）对称裂解生成藏红花酸二醛（crocetin dialdehyde）的类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD），并澄清此前关于ZCD酶功能的争议。
研究策略
利用454转录组深度测序分析藏红花柱头六个发育阶段，鉴定差异表达的CCD基因；通过大肠杆菌体内表达、玉米胚乳瞬时表达、体外酶活测定和亚细胞定位等方法，对候选CCD2和ZCD进行功能验证。
核心内容
该研究通过454转录组深度测序分析藏红花柱头六个发育阶段，鉴定到一个新型类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD2，并证明其是藏红花素生物合成途径中催化玉米黄质7,8/7',8'双键裂解的首个专属酶。研究发现藏红花柱头可积累高达干重8%的藏红花素类物质，CCD2表达峰值出现在橙色柱头期，与藏红花素积累动态一致，且该酶定位于细胞质。在大肠杆菌中表达CCD2可使积累玉米黄质的菌落明显褪色，并通过LC-HRMS检测到crocetin dialdehyde产物；在玉米胚乳中瞬时表达CCD2导致玉米黄质含量从1.98±0.33降至0.84±0.18，并产生crocetin。体外酶活测定显示CCD2对3-OH-β-apo-8'-carotenol转化率最高（52.7%），对玉米黄质为4.8%，且不裂解β-胡萝卜素、番茄红素等底物。该研究同时推翻了此前关于ZCD具有催化活性的观点，证明ZCD是无活性的CCD4 N端截短形式，缺少β-螺旋桨的一个叶片。CCD2属于与CCD1相近但独立的新进化分支，其鉴定完善了藏红花素生物合成的起始步骤，为合成生物学重构完整藏红花素途径奠定了基础。
创新点
1. 首次鉴定并命名了新型类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD2，其属于与CCD1相近但独立的新进化分支；2. 证明CCD2是藏红花素生物合成途径中催化玉米黄质7,8/7',8'双键裂解的第一步专属酶；3. 推翻此前关于ZCD具有催化活性的观点，证明ZCD是CCD4的N端截短形式，缺少β-螺旋桨的一个叶片，无裂解活性；4. 阐明了CCD2分两步连续裂解玉米黄质的机制。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成 | crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ | — | 催化 | 用于积累番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质的工程菌株 |
| Zea mays（玉米胚乳） | 类胡萝卜素合成 | CCD2 (KJ541749) | CCD2 | 催化 | 瞬时表达CCD2后玉米胚乳中玉米黄质和叶黄素含量显著降低，检测到crocetin |
| Crocus sativus | 藏红花素生物合成途径 | CCD2 | CCD2 | 催化 | 催化玉米黄质7,8/7',8'双键裂解，生成crocetin dialdehyde |
| Crocus sativus | 类胡萝卜素代谢 | ZCD | ZCD | 催化 | 被证明是CCD4的N端截短形式，缺少β-螺旋桨VII叶片，无活性 |
| Crocus sativus | 藏红花素生物合成途径 | CCD4a, CCD4b, CCD4c | CCD4 | 催化 | 三个等位CCD4转录本，表达时期较晚 |
| Crocus sativus | 类胡萝卜素代谢 | CCD1 | CCD1 | 催化 | 与CCD2进化关系相近，广泛裂解类胡萝卜素 |
| Synechocystis sp. | 类胡萝卜素代谢 | ACO | ACO | 催化 | 作为结构建模模板和系统发育外群 |
| Nicotiana benthamiana | 亚细胞定位 | CCD2:GFP | CCD2 | 调控 | 通过农杆菌浸润和共聚焦显微镜证明CCD2定位于细胞质 |
关键发现
- 藏红花柱头可积累高达干重8%的藏红花素类物质
- 通过454测序在6个柱头发育阶段中共鉴定到7个CCD转录本，包括CCD1、CCD7、三个CCD4等位变异体、ZCD及新发现的CCD2
- CCD2表达峰值出现在橙色柱头期（O期），与藏红花素积累动态一致
- 在大肠杆菌中表达CCD2可使积累玉米黄质的菌落明显褪色，并通过LC-HRMS检测到m/z
- 1847的crocetin dialdehyde标准品共流出峰
- ZCD在大肠杆菌、玉米胚乳和体外试验中均无裂解活性
- 在玉米胚乳中瞬时表达CCD2导致玉米黄质含量从1.98±0.33降至0.84±0.18（标准化离子峰面积），叶黄素从0.81±0.15降至0.48±0.05，并产生crocetin（m/z
- 1747）
- 体外试验中CCD2对3-OH-β-apo-8'-carotenol转化率最高（52.7%），对3-OH-β-apo-12'-carotenol为18.5%，对3-OH-β-apo-10'-carotenol为12.5%，对玉米黄质为4.8%，对叶黄素为1.7%
- CCD2不裂解β-胡萝卜素、番茄红素、紫黄质、β-隐黄质等底物
- CCD2为细胞质定位蛋白。
研究结论
CCD2是藏红花素生物合成中催化玉米黄质第一步裂解的关键酶，其通过连续两次在7,8和7',8'位点裂解生成藏红花酸二醛；ZCD是无活性的CCD4截短形式；该研究完善了藏红花类胡萝卜素代谢途径的起始步骤，为未来通过合成生物学重构完整藏红花素途径奠定了基础。