Orthologs of the archaeal isopentenyl phosphate kinase regulate terpenoid production in plants
- 作者
- Laura K. Henry, Michael Gutensohn, Suzanne T. Thomas, Joseph P. Noel, Natalia Dudareva
- 单位
- Department of Biochemistry, Purdue University; Department of Horticulture and Landscape Architecture, Purdue University; Jack H. Skirball Center for Chemical Biology and Proteomics, Salk Institute for Biological Studies; Howard Hughes Medical Institute, Salk Institute for Biological Studies
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2015）
- DOI
- 10.1073/pnas.1504798112
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物中广泛存在的古菌异戊烯基磷酸激酶（IPK）同源物在萜类代谢网络中的功能角色及其对萜类生物合成的调控机制尚不清楚。
研究策略
通过共表达分析、亚细胞定位、基因敲除/敲低、双突变体构建、过表达、酶动力学分析及代谢通路抑制剂处理，系统研究IPK在植物萜类代谢中的功能和调控机制。
核心内容
该研究系统揭示了植物中古菌异戊烯基磷酸激酶（IPK）同源物的功能。研究者以拟南芥为对象，通过共表达分析、亚细胞定位、基因敲除与过表达、酶动力学及抑制剂处理等手段，发现AtIPK定位于细胞质，与甲羟戊酸（MVA）途径及下游萜类基因共表达。酶动力学显示AtIPK对异戊烯基磷酸（IP）和二甲基烯丙基磷酸（DMAP）的催化效率相近（kcat/KM分别为10.1×10⁴和8.5×10⁴ s⁻¹·M⁻¹），而对香叶基磷酸活性极低。ipk突变体使菜油甾醇和谷甾醇含量分别降至野生型的50%和37%，β-石竹烯排放降低25–31%；而过表达AtIPK的烟草中多种甾醇增加2.0–3.0倍，倍半萜排放达3.4倍。机制上，IP和DMAP可竞争性抑制法尼基二磷酸合酶（FPPS1），IC50约为99 μM和94 μM，IPK通过回收这些代谢物解除抑制并扩大前体池。该研究确立了IPK作为植物萜类网络新成员的角色，提出通过内源代谢物再活化提升萜类产量的代谢工程策略。
创新点
发现植物IPK是萜类代谢网络的新成员，通过回收IP/DMAP以增加IPP/DMAPP前体池，并解除IP/DMAP对法尼基二磷酸合酶（FPPS）的抑制，从而调控萜类产量；提出了基于内源代谢物再活化的萜类代谢工程新策略。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | MVA途径 | AtIPK (At1g26640) | 异戊烯基磷酸激酶 (IPK) | 催化 | 定位于细胞质，催化IP和DMAP磷酸化为IPP和DMAPP，参与调控萜类前体比例 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | MVA途径 | AtMDD1 (At2g38700) | 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 (MDD1) | 催化 | 催化MVAPP脱羧生成IPP，对MVAPP的偏好性比MVAP高约10^4倍 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | MVA途径 | AtMDD2 (At3g54250) | 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 (MDD2) | 催化 | 与AtMDD1功能类似，对MVAPP具有高底物偏好性 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 萜类下游途径（FPP合成） | AtFPPS1 (At5g47770) | 法尼基二磷酸合酶1 (FPPS1) | 催化 | 受IP和DMAP竞争性抑制（IC50分别为99±2 μM和94±2 μM），调控碳流向倍半萜和甾醇 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | MVA和MEP途径 | AtIPK（过表达） | 异戊烯基磷酸激酶 (IPK) | 催化 | 过表达AtIPK使甾醇增加2.0-3.0倍，倍半萜排放增加至3.4倍，单萜增加近2倍 |
关键发现
- AtIPK定位于细胞质，与MVA途径及下游萜类基因共表达。AtMDD1和AtMDD2对MVAPP的催化效率（kcat/KM约1.2×10^5 s^-1·M^-1）比MVAP（约10^1 s^-1·M^-1）高约10^4倍。AtIPK对IP和DMAP的催化效率相近（kcat/KM分别为10.1×10^4和8.5×10^4 s^-1·M^-1），对GP活性极低。ipk突变体（ipk1无表达，ipk2表达降低83%）中菜油甾醇和谷甾醇含量分别降至野生型的50%和37%，β-石竹烯排放降低25-31%
- mdd1单突变体中菜油甾醇和谷甾醇分别降低45-58%和27-37%，β-石竹烯降低31-38%
- ipk1/mdd1-1双突变体中谷甾醇进一步降低58-82%。过表达AtIPK的烟草中胆固醇、豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇分别增加2.0、3.0、2.2、2.5倍，倍半萜（β-石竹烯和5-epi-马兜铃烯）排放增加至3.4倍，单萜（β-罗勒烯和芳樟醇）增加近2倍。AtFPPS1受IP和DMAP抑制，IC50分别为99±2 μM和94±2 μM，抑制分别对IPP和DMAPP呈竞争性、对另一种底物非竞争性。抑制剂处理表明IPK过表达同时增强MVA和MEP途径对单萜和倍半萜形成的贡献。
研究结论
IPK是植物萜类代谢网络的重要新成员，通过回收IP/DMAP生成IPP/DMAPP并缓解IP/DMAP对FPPS的抑制，在平行于经典MVA途径的位置调控萜类化合物的形成。过表达IPK可显著提高萜类产量，为代谢工程提供了一种通过内源代谢物再活化提高目标产物合成的新途径。