The bHLH transcription factor BIS1 controls the iridoid branch of the monoterpenoid indole alkaloid pathway in Catharanthus roseus
- 作者
- Alex Van Moerkercke, Priscille Steensma, Fabian Schweizer, Jacob Pollier, Ivo Gariboldi, Richard Payne, Robin Vanden Bossche, Karel Miettinen, Javiera Espoz, Purin Candra Purnama, Franziska Kellner, Tuulikki Seppänen-Laakso, Sarah E. O'Connor, Heiko Rischer, Johan Memelink, Alain Goossens
- 单位
- Department of Plant Systems Biology, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), 9052 Gent, Belgium; Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent University, 9052 Gent, Belgium; Institute of Biology, Leiden University, 2300 RA Leiden, The Netherlands; Department of Biological Chemistry, John Innes Centre, Norwich NR4 7UH, United Kingdom; VTT Technical Research Centre of Finland Ltd., FIN-02044 VTT, Espoo, Finland
- 杂志
- PNAS（2015）
- DOI
- 10.1073/pnas.1504951112
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
长春花中单萜吲哚生物碱（MIA）途径的iridoid分支缺乏已知的转录调控因子，该分支是MIA合成的限速步骤，而已知调控因子ORCA3不调控该分支。
研究策略
通过转录组共表达分析和功能筛选，在长春花中鉴定受茉莉酸调控的bHLH转录因子BIS1，验证其对iridoid基因启动子的反式激活作用，并通过稳定过表达和沉默实验评估其对MIA产量的影响。
核心内容
长春花单萜吲哚生物碱（MIA）合成途径中，iridoid分支是限速步骤，且缺乏已知的转录调控因子。本研究通过转录组共表达分析，鉴定出一个受茉莉酸调控的bHLH转录因子BIS1。功能实验表明，BIS1能特异性反式激活iridoid分支基因启动子，在烟草原生质体中将pG8O启动子激活95.3倍，而ORCA3和MYC2仅分别激活1.7倍和1.1倍；对大多数iridoid启动子的激活幅度达31至95倍，显著强于ORCA3。在稳定过表达BIS1的长春花悬浮细胞系中，木犀草酸、马钱苷、长春质碱、蛇根碱、他波宁等MIA产物积累至对照细胞不可检测的水平，且无需外源前体或茉莉酸诱导。但在毛状根中过表达BIS1虽上调iridoid和MEP途径基因，MIA总量未增加，原因是ORCA3靶基因（如LAMT、SLS、TDC、SGD）表达下调；沉默BIS1则导致MIA积累显著降低。这表明BIS1是iridoid分支特异性的转录激活因子，与ORCA3在MIA途径中功能互补，为通过代谢工程提高长春花细胞培养中高价值MIA的可持续生产提供了新工具。
创新点
鉴定出一个新的bHLH转录因子BIS1，它特异性激活iridoid分支基因（上游至木犀草酸），与ORCA3互补；过表达BIS1足以在长春花悬浮细胞中提高MIA产量，无需外源前体或茉莉酸诱导。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus | MIA生物合成（iridoid分支） | BIS1 | bHLH转录因子BIS1 | 调控 | 茉莉酸诱导的bHLH转录因子，特异性激活iridoid分支基因（如G8O，GES，IS等）及MEP途径基因 |
| Catharanthus roseus | MIA生物合成（indole分支） | ORCA3 | AP2/ERF转录因子ORCA3 | 调控 | 已知调控STR、TDC及下游MIA基因，不激活iridoid上游基因 |
| Catharanthus roseus | 茉莉酸信号传导 | MYC2 | bHLH转录因子MYC2 | 调控 | 茉莉酸信号通路核心调控因子，调控ORCA3表达，但对iridoid启动子无显著激活 |
| Catharanthus roseus | iridoid生物合成 | G8O | 香叶醇-8-氧化酶 | 催化 | 催化geraniol向8-hydroxygeraniol转化，BIS1直接靶标 |
| Catharanthus roseus | iridoid生物合成 | GES | 香叶醇合酶 | 催化 | 催化GPP生成geraniol，BIS1直接靶标 |
| Catharanthus roseus | iridoid生物合成 | 8HGO | 8-羟基香叶醇氧化酶 | 催化 | 催化8-hydroxygeraniol氧化，BIS1直接靶标 |
| Catharanthus roseus | iridoid生物合成 | IS | 环烯醚萜合酶 | 催化 | 催化8-oxogeranial环化形成iridodial，BIS1直接靶标 |
| Catharanthus roseus | iridoid生物合成 | IO | 环烯醚萜氧化酶 | 催化 | 催化iridodial氧化，BIS1未显著激活其启动子 |
| Catharanthus roseus | iridoid生物合成 | 7DLGT | 7-脱氧马钱苷酸葡萄糖基转移酶 | 催化 | 催化7-deoxyloganetic acid糖基化，BIS1直接靶标 |
| Catharanthus roseus | iridoid生物合成 | 7DLH | 7-脱氧马钱苷酸羟化酶 | 催化 | 催化7-deoxyloganetin hydroxylation，BIS1直接靶标 |
| Catharanthus roseus | iridoid生物合成 | LAMT | 马钱苷酸O-甲基转移酶 | 催化 | 位于iridoid分支末端，不受BIS1直接激活，但在BIS1过表达细胞中上调 |
| Catharanthus roseus | MIA生物合成 | SLS | 马钱苷合酶 | 催化 | 催化secologanin形成，ORCA3靶基因 |
| Catharanthus roseus | MIA生物合成 | STR | 异胡豆苷合酶 | 催化 | 催化secologanin与tryptamine缩合形成strictosidine，ORCA3靶基因 |
| Catharanthus roseus | MIA生物合成 | TDC | 色氨酸脱羧酶 | 催化 | 催化tryptophan脱羧形成tryptamine，ORCA3靶基因 |
| Catharanthus roseus | MEP途径 | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | MEP途径关键酶，BIS1过表达时上调，提供IPP前体 |
| Catharanthus roseus | MEP途径 | HDS | (E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸合酶 | 催化 | MEP途径酶，BIS1过表达时上调 |
| Catharanthus roseus | MEP途径 | MECS | 2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸合酶 | 催化 | MEP途径酶，BIS1过表达时上调 |
| Catharanthus roseus | MEP途径 | GPP synthase small subunit | 香叶基二磷酸合酶小亚基 | 催化 | BIS1过表达时上调，增加GPP供应 |
关键发现
- BIS1在烟草原生质体中将pG8O反式激活95.3倍，而ORCA3和MYC2仅激活1.7倍和1.1倍
- BIS1可将大多数iridoid启动子激活31-95倍，而ORCA3仅微弱激活（pIS为4.9倍，pSTR1为24.7倍）。在稳定过表达BIS1的长春花MP183L悬浮细胞系中，木犀草酸、马钱苷、长春质碱、蛇根碱、他波宁等MIA积累到对照细胞不可检测的水平
- 同时MEP途径基因和iridoid基因上游转录上调。在毛状根中BIS1过表达上调iridoid和MEP基因，但MIA积累未增加，原因是ORCA3靶基因（如LAMT、SLS、TDC、SGD）表达下调。沉默BIS1导致毛状根中MIA积累显著降低。
研究结论
BIS1是iridoid分支的特异性转录激活因子，与ORCA3互补调控MIA途径，可作为代谢工程工具提高长春花细胞培养中高价值MIA的可持续生产。