Building carbon-carbon bonds using a biocatalytic methanol condensation cycle
- 作者
- Igor W. Bogorad, Chang-Ting Chen, Matthew K. Theisen, Tung-Yun Wu, Alicia R. Schlenz, Albert T. Lam, James C. Liao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Los Angeles; Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles; UCLA-DOE Institute for Genomics and Proteomics, University of California, Los Angeles
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2014）
- DOI
- 10.1073/pnas.1413470111
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
甲醇转化为更长碳链化合物通常需要高温高压的化学过程，而天然生物途径存在碳损失或ATP消耗，难以高效且碳守恒地构建C-C键。
研究策略
将核酮糖单磷酸途径（RuMP）与非氧化糖酵解（NOG）组合，构建甲醇缩合循环（MCC），利用酶促反应实现无碳损失、不依赖ATP的甲醇到高级醇的转化。
核心内容
该研究将一个甲醇缩合循环（MCC）整合了核酮糖单磷酸途径与非氧化糖酵解，旨在实现无碳损失、不依赖ATP的碳-碳键构建。研究者通过酶动力学模拟和体外实验发现磷酸酮醇酶存在动力学陷阱，当其浓度约90 mg/L时乙酸产量达到峰值，更高浓度反而使总乙酸产量下降两倍。利用13C-甲醛示踪，完整循环产生双标记乙醇（m/z 48离子），而缺失转醛醇酶的对照组无此信号，证实了催化循环的运转。在连续生产实验中，以6 mM/h甲醛和0.5 mM/h核酮糖-5-磷酸补料，可稳定生成乙醇。从200 mM甲醇经24小时获得610 mg/L乙醇，碳收率达80%，显著超过天然RuMP-EMP途径66%的理论上限；同样条件下还获得170 mg/L正丁醇，碳收率约50%，其余碳分布于乙醇和糖磷酸降解产物。这一成果证明MCC途径能以完全碳守恒且温和的条件将甲醇转化为更长碳链的醇类，为利用天然气衍生甲醇生产液体燃料和化学品开辟了高碳效率的新路线。
创新点
首次构建了一个完全碳守恒且ATP独立的甲醇缩合循环（MCC），通过磷酸酮醇酶保留磷酸键避免碳损失，并用13C标记验证了循环的催化特性；利用细胞-free系统实现甲醇到乙醇和正丁醇的转化。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 甲醇缩合循环 (MCC) | hps | 己酮糖-6-磷酸合酶 (Hps) | 催化 | 催化甲醛与Ru5P缩合生成己酮糖-6-磷酸 |
| — | 甲醇缩合循环 (MCC) | phi | 磷酸己糖异构酶 (Phi) | 催化 | 催化己酮糖-6-磷酸异构为果糖-6-磷酸 |
| — | 甲醇缩合循环 (MCC) | xpk/fpk | 磷酸酮醇酶 (F/Xpk) | 催化 | 裂解F6P或X5P生成乙酰磷酸，动力学校准的关键酶 |
| — | 甲醇缩合循环 (MCC) | pta | 磷酸转乙酰酶 (Pta) | 催化 | 将乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A |
| — | 甲醇缩合循环 (MCC) | tal | 转醛醇酶 (Tal) | 催化 | 参与碳骨架重排，缺失则循环无法运转 |
| — | 甲醇缩合循环 (MCC) | tkt | 转酮醇酶 (Tkt) | 催化 | 参与碳重排，再生Ru5P |
| — | 甲醇缩合循环 (MCC) | rpi | 核糖-5-磷酸异构酶 (Rpi) | 催化 | 催化Ru5P与R5P互变 |
| — | 甲醇缩合循环 (MCC) | rpe | 核酮糖-5-磷酸表异构酶 (Rpe) | 催化 | 催化Ru5P与X5P互变 |
| — | 甲醇氧化 | mdh | NAD依赖性甲醇脱氢酶 (Mdh) | 催化 | 氧化甲醇为甲醛，来自Bacillus methanolicus，活性低 |
| — | 甲醇氧化（替代） | adh | 醇脱氢酶 (Adh) | 催化 | 来自酿酒酵母，用于甲醇氧化及乙醇/丁醇生成 |
| — | 乙醇合成 | pdP | 乙酰化乙醛脱氢酶 (PduP) | 催化 | 来自Bacillus methanolicus或Salmonella enterica，将乙酰-CoA还原为乙醛 |
| — | 正丁醇合成 | atob | 硫解酶 (Atob) | 催化 | 来自大肠杆菌，缩合两分子乙酰-CoA |
| — | 正丁醇合成 | hbd | 3-羟基丁酰-CoA脱氢酶 (Hbd) | 催化 | 来自丙酮丁醇梭菌 |
| — | 正丁醇合成 | crt | 巴豆酸酶 (Crt) | 催化 | 来自丙酮丁醇梭菌 |
| — | 正丁醇合成 | ter | 反式烯酰-CoA还原酶 (Ter) | 催化 | 来自齿垢密螺旋体 |
| — | NADH再生 | fdh | 甲酸脱氢酶 (Fdh) | 催化 | 来自博伊丁假丝酵母，氧化甲酸提供NADH |
| — | 磷酸盐转运 | — | 无机磷酸盐 | 能量供给 | 磷酸酮醇酶利用无机磷酸盐实现底物水平磷酸化，避免ATP消耗 |
关键发现
- 通过EMRA模拟和体外实验发现磷酸酮醇酶（F/Xpk）存在动力学陷阱，当F/Xpk浓度约90 mg/L时乙酸产量最高，高于此值总乙酸产量下降两倍
- 利用13C-甲醛示踪，完整MCC途径产生双标记乙醇（m/z 48离子），而缺少转醛醇酶（Tal）的对照无48离子，证实了催化循环
- 连续生产乙醇时，以6 mM/h甲醛和0.5 mM/h R5P补料，乙醇持续生成
- 从200 mM（6200 mg/L）甲醇经24小时获得610 mg/L（13.3 mM）乙醇，碳收率80%（消耗33.5 mM甲醇），超过天然RuMP-EMP途径的理论收率66%
- 从200 mM甲醇获得170 mg/L（2.3 mM）正丁醇，甲醇消耗21.1 mM，碳收率50%，其余碳分布于乙醇（约15%）、乙酸及糖磷酸降解产物。
研究结论
MCC途径能够以完全碳守恒且不依赖ATP的方式将甲醇转化为乙醇和正丁醇，具有高碳效率和温和操作条件，为利用天然气衍生甲醇生产长链液体燃料和化学品提供了新方案。