高级醇 · 代谢工程文献库

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Unearthing a sesterterpene biosynthetic repertoire in the Brassicaceae through genome mining reveals convergent evolution

作者
Ancheng C. Huang, Satria A. Kautsar, Young J. Hong, Marnix H. Medema, Andrew D. Bond, Dean J. Tantillo, Anne Osbourn
单位
Department of Metabolic Biology, John Innes Centre; Bioinformatics Group, Wageningen University; Department of Chemistry, University of California, Davis; Department of Chemistry, University of Cambridge
杂志
Proceedings of the National Academy of Sciences（2017）
DOI
10.1073/pnas.1705567114
所属领域
合成生物学/代谢工程
关键词
Brassicaceaeconvergent evolutioncyclization mechanismplant natural productssesterterpene biosynthesis
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解决的核心问题

十字花科植物中二倍半萜合酶基因的挖掘与功能解析，以及植物与真菌二倍半萜合酶趋同进化的机制研究

研究策略

利用定制化plantSMASH算法系统挖掘55个植物基因组中PT与TPS共定位的基因对，结合系统发育分析、烟草瞬时异源表达、产物分离与结构鉴定、同源建模、定点突变和量子化学计算，揭示二倍半萜合酶的功能与环化机制

研究路线图

100%
基因组挖掘
（55个植物基因组）
定制plantSMASH
PT-TPS共定位分析
系统发育分析
筛选候选基因
烟草瞬时表达
7个TPS酶活验证
产物分离鉴定
8种真型二倍半萜
AtTPS19定点突变
环化路径解析
量子化学计算
能垒比较
拟南芥组织检测
验证天然产物存在
结论：植物与真菌
趋同进化机制
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核心内容

该研究通过定制化的plantSMASH算法系统挖掘了55个植物基因组，筛选出21个高严格度的PT-TPS共定位基因对，并在烟草中瞬时表达了其中7个TPS基因，成功合成8种真菌型二倍半萜（化合物2-9），其中化合物2的纯化产量达102.0 mg，为功能验证提供了充足材料。通过同源建模与定点突变，研究解析了AtTPS19中Tyr428Asp突变对五环二倍半萜(-)-retigeranin B环化路径的影响，突变后其占比从42%降至30%，同时中间产物积累，结合量子化学计算揭示了astellatene两条环化路径中能垒差异（路径1比路径2低6 kcal/mol）。拟南芥组织表达分析显示化合物2和3在角果与种子中富集，而4和6仅在根中检出。该工作系统扩展了十字花科二倍半萜合酶基因家族，证明植物与真菌二倍半萜合酶虽序列同一性仅约10%，却能催化相似骨架合成，提示二者通过趋同进化独立演化出相近的环化策略，为二倍半萜的代谢工程与蛋白质工程设计提供了新靶点。

创新点

['首次系统鉴定十字花科中大量PT-TPS共定位基因对，扩展了植物二倍半萜合酶基因家族', '发现多种新型真菌型二倍半萜，包括真菌代谢物(+)-quinannulatene的对映体(-)-ent-quinannulatene', '通过定点突变AtTPS19的Tyr428Asp揭示了五环二倍半萜(-)-retigeranin B的环化路径', '基于系统发育和功能分析，提出植物与真菌二倍半萜合酶趋同进化的观点']

研究对象（18）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 AtTPS17 AtTPS17 二倍半萜合酶 催化 来自拟南芥，与AtGFPPS共表达产生二倍半萜
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 AtTPS18 AtTPS18 二倍半萜合酶 催化 合成(+)-arathanatriene (2)
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 AtTPS19 AtTPS19 二倍半萜合酶 催化 合成(-)-retigeranin B (3)；Tyr428Asp突变改变产物谱
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 AtTPS25 AtTPS25 二倍半萜合酶 催化 合成(-)-ent-quinannulatene (4)及(-)-variculatriene A (5)
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 AtTPS30 AtTPS30 二倍半萜合酶 催化 合成(+)-astellatene (6)
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 Cr237 Cr237 二倍半萜合酶 催化 来自Capsella rubella，合成(-)-caprutriene (7)
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 Bo250 Bo250 二倍半萜合酶 催化 来自Brassica oleracea，合成(+)-boleracene (8)及(-)-aleurodiscalene A (9)
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 AtGFPPS1 AtGFPPS1 香叶基法尼基焦磷酸合酶 催化 合成GFPP前体
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 AtGFPPS3 AtGFPPS3 香叶基法尼基焦磷酸合酶 催化 合成GFPP前体
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 AtGFPPS4 AtGFPPS4 香叶基法尼基焦磷酸合酶 催化 合成GFPP前体
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 CrGFPPS1 CrGFPPS1 香叶基法尼基焦磷酸合酶 催化 来自Capsella rubella
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 BoPT1 BoPT1 香叶基法尼基焦磷酸合酶 催化 来自Brassica oleracea
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 AtTPS22 AtTPS22 萜烯合酶 催化 非共定位TPS，未检测到二倍半萜活性
Nicotiana benthamiana 二倍半萜生物合成 AtTPS29 AtTPS29 萜烯合酶 催化 非共定位TPS，未检测到二倍半萜活性
Arabidopsis thaliana 二倍半萜生物合成 AtTPS18 AtTPS18 二倍半萜合酶 催化 在植株中检测到产物(+)-arathanatriene
Arabidopsis thaliana 二倍半萜生物合成 AtTPS19 AtTPS19 二倍半萜合酶 催化 在植株中检测到产物(-)-retigeranin B
Arabidopsis thaliana 二倍半萜生物合成 AtTPS25 AtTPS25 二倍半萜合酶 催化 在植株根中检测到产物(-)-ent-quinannulatene
Arabidopsis thaliana 二倍半萜生物合成 AtTPS30 AtTPS30 二倍半萜合酶 催化 在植株根中检测到产物(+)-astellatene

关键发现

  1. 从55个植物基因组中鉴定出2,846个TPS序列，其中21个高严格度PT-TPS共定位基因对
  2. 7个TPS在烟草中表达具有二倍半萜合酶活性，合成8种真菌型二倍半萜（2-9），纯化产量分别为2（102.0 mg）、3（13.0 mg）、4（3.7 mg）、5（3.5 mg）、6（4.2 mg）、7（21.3 mg）、8（17.3 mg）、9（2.1 mg）
  3. 突变AtTPS19 Tyr428Asp后，(-)-retigeranin B占比从42%降至30%，(+)-arathanatriene从5.5%升至12%，并积累中间产物(-)-fusaproliferene等
  4. 量子化学计算表明astellatene两条环化路径中路径1能垒比路径2低6 kcal/mol
  5. 拟南芥不同组织中检测到2、3、4、6，其中2和3在角果和种子中丰富，4和6仅在根中检测到

研究结论

植物二倍半萜合酶与真菌对应酶虽氨基酸序列同一性仅约10%，但能催化相似甚至相同骨架的合成，表明二者通过趋同进化独立演化出相似的环化策略；十字花科中PT-TPS基因对可能起源于共同祖先基因对；这些发现为二倍半萜的代谢工程和蛋白质工程生产提供新机遇