高级醇 · 代谢工程文献库

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Biosynthesis of terpenes: Studies on 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase

作者
Petra Adam, Stefan Hecht, Wolfgang Eisenreich, Johannes Kaiser, Tobias Gräwert, Duilio Arigoni, Adelbert Bacher, Felix Rohdich
单位
Lehrstuhl für Organische Chemie und Biochemie, Technische Universität München, Lichtenbergstrasse 4, D-85747 Garching, Germany; Laboratorium für Organische Chemie, Eidgenössische Technische Hochschule Zürich HCI, CH-8093 Zürich, Switzerland
杂志
PNAS（2002）
DOI
10.1073/pnas.182412599
所属领域
代谢工程
关键词
deoxyxyluloseisopentenyl diphosphateisoprenoidsispHlytB
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解决的核心问题

阐明IspH蛋白催化1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸（HMBPP）还原为异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）的体外反应条件与机制。

研究策略

采用重组DNA技术将大肠杆菌ispH(lytB)基因与malE融合表达，亲和纯化融合蛋白；利用放射性标记和13C标记底物进行酶活测定，结合HPLC和NMR分析产物；比较野生型与重组菌粗提物、纯化蛋白及植物色素体的活性，验证辅因子需求并探寻未知辅助蛋白。

研究路线图

100%
研究问题：IspH催化HMBPP还原机制与条件
策略：ISP基因与malE融合表达，同位素标记底物测活
关键改造1：构建重组菌及纯化MalE/IspH蛋白
关键改造2：酶活测定系统（辅因子、底物、产物分析）
结果：粗提物催化转化，产物为IPP/DMAPP（5:1）
结果：纯化IspH单独无活性，需未知辅助蛋白；增强粗提物4.5倍活性
结果：辣椒色素体活性被重组IspH增强4倍
结论：IspH为限速酶与药物靶点
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核心内容

该研究通过重组DNA技术将大肠杆菌ispH(lytB)基因与malE融合表达并亲和纯化，首次实现了IspH蛋白催化1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸（HMBPP）还原为异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）的体外反应。酶活测定显示反应依赖NADH、FAD和Co2+，缺失NADH、FAD或Co2+时相对活性分别降至12%、17%和20%，添加EDTA则完全抑制；Co2+优于Mn2+（48%）和Fe2+（21%），产物中IPP与DMAPP比例约为5:1。纯化的MalE/IspH融合蛋白单独无活性，但可将野生型大肠杆菌粗提物活性提高至4.5倍，辣椒色素体催化活性也可被重组IspH增强约4倍，补充粗提物后重组IspH比活性约为2 nmol·mg-1·min-1。结果表明IspH是催化非甲羟戊酸途径最后一步的关键酶，其活性需要NADH、FAD、二价金属离子及一个或多个未知辅助蛋白（可能作为电子穿梭体）参与，该酶可能是途径限速步骤，也是抗感染药物开发的潜在靶点。

创新点

首次实现IspH蛋白的体外催化转化并确认反应条件；发现纯化的融合蛋白单独无活性但能增强粗提物活性，提示IspH需要未知蛋白辅助；利用多种同位素标记底物和NMR确定了产物结构及IPP/DMAPP比例。

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli XL1-Blue 非甲羟戊酸途径（DXP途径） ispH (lytB) IspH（MalE/IspH融合蛋白） 催化 重组菌株XL1-pMALlytB表达MalE/IspH融合蛋白，催化HMBPP转化为IPP和DMAPP
Capsicum annuum 非甲羟戊酸途径（DXP途径） — — 催化 离体辣椒色素体具有内源IspH活性，可被纯化的重组IspH蛋白增强约4倍

关键发现

  1. 重组大肠杆菌粗提物可催化[1-3H]8转化为产物
  2. 反应依赖NADH、FAD和Co2+（缺NADH时相对活性12%，缺FAD 17%，缺Co2+ 20%，缺pamidronate 42%）
  3. 添加EDTA完全抑制
  4. Co2+优于Mn2+(48%)、Fe2+(21%)等
  5. 产物中IPP与DMAPP比例约为5:1
  6. 纯化的MalE/IspH融合蛋白单独无活性，但可将野生型E. coli粗提物活性提高至4.5倍
  7. 辣椒色素体催化活性可被重组IspH增强约4倍
  8. 重组IspH（补充粗提物）的比活性约为2 nmol·mg-1·min-1。

研究结论

IspH蛋白是催化非甲羟戊酸途径最后一步（HMBPP还原为IPP/DMAPP）的关键酶，其活性需要NADH、FAD、二价金属离子及一个或多个未知辅助蛋白，可能作为电子穿梭体；该酶可能是途径的限速步骤，也是抗感染药物开发的潜在靶点。