Biosynthesis of cabbage phytoalexins from indole glucosinolate
- 作者
- Andrew P. Klein, Elizabeth S. Sattely
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Stanford University, Stanford, CA 94305
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（2017）
- DOI
- 10.1073/pnas.1615625114
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析十字花科植物吲哚硫代葡萄糖苷代谢产生吲哚硫植物抗毒素（特别是关键前体brassinin）所必需的生物合成酶系，弥补拟南芥中缺失而芸苔属植物中存在的途径空白。
研究策略
综合运用化学逻辑推断酶家族、病原菌诱导的转录组分析（RNA-seq）以及拟南芥与芜菁（Brassica rapa）的比较基因组学，筛选候选基因；通过体外酶学表征和烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时表达系统进行功能验证与全途径重建。
核心内容
该研究解析了十字花科植物从吲哚硫代葡萄糖苷合成吲哚硫植物抗毒素brassinin的关键酶系。通过化学逻辑推断、病原菌诱导转录组分析和拟南芥与芜菁的比较基因组学筛选候选基因，结合体外酶学表征与烟草瞬时表达进行功能验证。研究发现碳-硫裂解酶SUR1具有处理半胱氨酸-异硫氰酸酯加合物的新功能，鉴定出催化S-甲基化的甲基转移酶DTCMT及具有芥子酶活性的β-葡萄糖苷酶BABG。在烟草中联合表达吲哚硫代葡萄糖苷途径基因、TGG4或BABG及DTCMT后，brassinin积累量约400 pmol/mg干重，与天然生产者芜菁中的水平相当。体外实验表明DTCMT.b活性仅为DTCMT.a的约5%。brassinin对植物病原真菌的EC50为10–140 μM，对人吲哚胺2,3-双加氧酶Ki为28 μM。该工作首次在非十字花科植物中实现从色氨酸到brassinin的异源全合成，为十字花科植物抗毒素生物学功能与健康影响研究提供代谢工程工具。
创新点
揭示已知碳-硫裂解酶SUR1在brassinin合成中的新功能（处理半胱氨酸-异硫氰酸酯加合物）；鉴定出催化二硫代氨基甲酸酯S-甲基化的甲基转移酶DTCMT及具有芥子酶活性的β-葡萄糖苷酶BABG；首次在非十字花科植物烟草中实现从色氨酸到brassinin及下游植物抗毒素的异源全合成。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 吲哚硫代葡萄糖苷/brassinin生物合成 | AtSUR1 / BrSUR1 | 碳-硫裂解酶 SUPERROOT1 | 催化 | 体外验证可裂解Cys-异硫氰酸酯生成二硫代氨基甲酸酯，同时参与硫代肟酸裂解 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | brassinin生物合成 | DTCMT.a (Bra.B01660) / DTCMT.b (Bra.G00303) | 二硫代氨基甲酸酯S-甲基转移酶（SABATH家族） | 催化 | DTCMT.a催化SAM依赖的S-甲基化生成brassinin；DTCMT.b活性仅为DTCMT.a的约5% |
| Nicotiana benthamiana (烟草) | 吲哚硫代葡萄糖苷/brassinin生物合成 | BABG.a (Bra.D02695) / BABG.b (Bra.E00436) | brassinin相关β-葡萄糖苷酶（BGLU亚家族4） | 催化 | 具有芥子酶活性，可激活吲哚硫代葡萄糖苷；在烟草中功能与经典TGG4相当 |
| Nicotiana benthamiana (烟草) | brassinin衍生植物抗毒素合成 | CYP71CR1 / CYP71CR2 | 细胞色素P450（CYP71CR亚家族） | 催化 | 分别催化brassinin转化为spirobrassinin或cyclobrassinin |
| Nicotiana benthamiana (烟草) | 吲哚硫代葡萄糖苷生物合成 | BrCYP79B2.a, BrCYP83B1, BrGSTF9.a, BrGGP1.a, BrSUR1.a, BrUGT74B1, BrSOT16.a, BrAPK1.a | 吲哚硫代葡萄糖苷途径酶（CYP79B2, CYP83B1, GSTF9, GGP1, SUR1, UGT74B1, SOT16, APK1） | 催化 | 基于拟南芥同源基因，瞬时表达使烟草积累吲哚硫代葡萄糖苷 |
| Arabidopsis thaliana | 芥子油苷代谢 | AtTGG4 | 经典芥子酶（BGLU亚家族7） | 催化 | 作为对照，在烟草中表达可替代BABG激活吲哚硫代葡萄糖苷；拟南芥本身不产生brassinin |
关键发现
- 体外实验证明AtSUR1和BrSUR1均可裂解Cys-异硫氰酸酯生成二硫代氨基甲酸酯，且SUR1催化硫代肟酸裂解与Cys-ITC裂解
- DTCMT.a催化SAM依赖的S-甲基化生成brassinin，DTCMT.b活性仅为DTCMT.a的约5%
- BABG.a/b具有芥子酶活性，可在烟草中替代经典myrosinase TGG4激活吲哚硫代葡萄糖苷
- 在烟草瞬时表达IG途径（CYP79B2,CYP83B1,GSTF9,GGP1,SUR1,UGT74B1,SOT16,APK1）和TGG4或BABG及DTCMT.a后，brassinin积累量约为400 pmol/mg干重，与天然生产者B. rapa中的水平相当
- brassinin对植物病原真菌的EC50为10-140 μM，对IDO的Ki为28 μM
- 基因上调筛选阈值为log2(fold change)>1.8。
研究结论
从吲哚硫代葡萄糖苷到brassinin的完整生物合成途径由硫代葡萄糖苷途径的已知酶（如SUR1）新功能、特异性的S-甲基转移酶DTCMT和β-葡萄糖苷酶BABG共同组成。该最小酶系可在烟草中重建产生brassinin及其衍生物，为通过代谢工程系统研究十字花科植物抗毒素的生物学功能及人类健康影响提供了工具。