Gene discovery and virus-induced gene silencing reveal branched pathways to major classes of bioactive diterpenoids in Euphorbia peplus
- 作者
- Tomasz Czechowski, Edith Forestier, Sandesh H. Swamidatta, Alison D. Gilday, Amy Cording, Tony R. Larson, David Harvey, Yi Li, Zhesi He, Andrew J. King, Geoffrey D. Brown, Ian A. Graham
- 单位
- Department of Biology, Centre for Novel Agricultural Products, University of York, York YO10 5DD, United Kingdom; Department of Chemistry, University of Reading, Reading RG6 6AD, United Kingdom
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（2022）
- DOI
- 10.1073/pnas.2203890119
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明 Euphorbia peplus 中 casbene 衍生的多环二萜类生物活性化合物（jatrophanes 和 ingenanes）的生物合成途径，特别是从 casbene 到 jolkinol C 之后的分支路径。
研究策略
采用代谢组学指导的转录组学、基因组学（BAC 文库筛选发现基因簇）、异源表达（本氏烟草和酿酒酵母）以及病毒诱导基因沉默（VIGS）相结合的方法，鉴定和验证参与二萜生物合成的候选基因。
核心内容
该研究综合运用代谢组学指导的转录组学、基因组学、异源表达及病毒诱导基因沉默（VIGS）技术，系统解析了大戟（Euphorbia peplus）中casbene衍生二萜类生物活性化合物的分支生物合成途径。共筛选获得68个候选基因并在基因组中发现两个二萜基因簇，其中簇1长达447 Kbp，含53个基因。通过本氏烟草和酵母异源表达，鉴定了短链脱氢酶/还原酶EpSDR-5，其催化C3位酮还原，将jolkinol C转化为jolkinol E。VIGS沉默EpSDR-5导致jatrophanes水平降低1.6–1.8倍，同时ingenanes增加1.4–1.7倍，而沉默EpCAS和CYP71D365均使两类化合物降低逾2倍，由此证明jolkinol C是两条途径的分支点：jatrophanes需经jolkinol E，而ingenanes不经此步。此外，在酿酒酵母中组合表达JcCAS、CYP726A20、CYP71D495和JcADH1，实现了jolkinol C产量达800 mg/L培养液。该研究为生物活性二萜的异源生产提供了关键基因工具和途径框架。
创新点
1) 发现两个 casbene 衍生的二萜基因簇；2) 鉴定 EpSDR-5 为 C3-酮还原酶，催化 jolkinol C 生成 jolkinol E；3) 首次在 E. peplus 中建立 VIGS 方法，并证明 jolkinol C 是 ingenanes 和 jatrophanes 生物合成的分支点。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Euphorbia peplus | 二萜生物合成（casbene 衍生物） | EpSDR-5 | 短链脱氢酶/还原酶 | 催化 | C3-酮还原酶，将 jolkinol C 还原为 jolkinol E；VIGS 沉默导致 jatrophanes 减少、ingenanes 增加 |
| Nicotiana benthamiana | jolkinol C 生物合成 | EpSDR-5 | 短链脱氢酶/还原酶 | 催化 | 瞬时表达验证其能将 jolkinol C 和 epi-jolkinol C 还原为 jolkinol E 和 epi-jolkinol E |
| Saccharomyces cerevisiae | jolkinol C 生物合成 | EpSDR-5 | 短链脱氢酶/还原酶 | 催化 | 在产 jolkinol C 的酵母菌株中异源表达，确认生成 jolkinol E |
| Euphorbia peplus | casbene 生物合成 | EpCAS | Casbene 合酶 | 催化 | VIGS 沉默后 jatrophanes 和 ingenanes 均降低超过 2 倍，证明它们是 casbene 衍生物 |
| Euphorbia peplus | jolkinol C 生物合成 | CYP71D365 | 细胞色素 P450 氧化酶（casbene-9-氧化酶） | 催化 | VIGS 沉默导致 jatrophanes 和 ingenanes 降低超过 2 倍，且积累 5-ketocasbene 和 6-hydroxy-5-ketocasbene |
| Jatropha curcas | jolkinol C 生物合成 | JcCAS, CYP726A20, CYP71D495, JcADH1 | casbene 合酶、细胞色素 P450 氧化酶、醇脱氢酶 | 催化 | 异源组合表达用于在烟草和酵母中生产 jolkinol C |
| Nicotiana benthamiana | 二萜修饰 | EpSDR-1 | 短链脱氢酶/还原酶 | 催化 | 生成 (3E,6E,11E)-8,9-dihydroxy-casaba-3,6,11-trien-5-one |
| Euphorbia peplus | 二萜生物合成（前体供给） | AtDXS, AtHDR, AtGGPPS | 萜类前体合成酶 | 催化 | 在烟草瞬时表达中提供异戊烯基前体支持 jolkinol C 生产 |
关键发现
- EpSDR-5 是 C3-酮还原酶，将 jolkinol C 转化为 jolkinol E，经酵母异源表达确认
- VIGS 沉默 EpSDR-5 导致 jatrophanes 水平显著降低
- 6-1.8 倍，同时 ingenanes 水平增加
- 4-1.7 倍
- VIGS 沉默 EpCAS（Casbene Synthase）使 jatrophanes 和 ingenanes 均降低超过 2 倍
- VIGS 沉默 CYP71D365 使茎中 jatrophanes 和 ingenanes 降低超过 2 倍，同时 peplusol 降低 2 倍
- E. peplus 乳胶中 ingenol-3-angelate (IM) 含量为
- 11 μg/mg 鲜重，其 20-乙酰化衍生物含量高 22 倍
- 在酿酒酵母中组合表达 JcCAS、CYP726A20、CYP71D495 和 JcADH1 可实现 jolkinol C 产量达 800 mg/L 培养液
- 通过 RNAseq 和 BAC 文库筛选共获得 68 个候选基因，其中仅 EpSDR-1 和 EpSDR-5 在烟草瞬时表达中对 jolkinol C/epi-jolkinol C 有活性
- 发现两个基因簇，簇1长 447 Kbp，含 53 个基因和 1 个反转录转座子，包含 14 个 P450 氧化酶同源基因。
研究结论
在 E. peplus 中，jatrophanes 和 ingenanes 都源自 casbene 并经过 jolkinol C，但两条途径在 jolkinol C 处分叉：jatrophanes 需要 EpSDR-5 催化 jolkinol C 生成 jolkinol E 后继续合成，而 ingenanes 不经过 jolkinol E。该研究提供了二萜生物合成途径的框架和基因工具，为异源生产生物活性二萜奠定了基础。