Molecular cloning and heterologous expression of the C-13 phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase that functions in Taxol biosynthesis
- 作者
- Kevin Walker, Shingo Fujisaki, Robert Long, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, WA 99164-6340
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2002）
- DOI
- 10.1073/pnas.192463699
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定紫杉醇生物合成中负责将苯丙烷侧链转移至巴卡亭III C-13羟基的酰基转移酶
研究策略
构建富含的cDNA文库，通过功能筛选，以baccatin III和β-苯丙氨酰辅酶A为底物，从候选转酰酶中鉴定目标克隆，并在大肠杆菌中异源表达、表征酶学性质
核心内容
该研究从东北红豆杉cDNA文库中克隆了编码C-13苯丙烷侧链辅酶A酰基转移酶（BAPT）的TAX7基因，该基因全长1335 bp，编码445个氨基酸。通过在大肠杆菌中异源表达重组酶，以巴卡亭III和β-苯丙氨酰辅酶A为底物进行功能验证，发现该酶能选择性催化巴卡亭III的13-O-酰化，生成N-去苯甲酰基-2'-脱氧紫杉醇，后者经化学N-苯甲酰化后得到2'-脱氧紫杉醇。酶学表征显示，该酶对巴卡亭III的Km为2.4±0.5 μM，对β-苯丙氨酰辅酶A的Km为4.9±0.3 μM，最适pH为6.8；其底物偏好性明确，对β-苯丙氨酰辅酶A的相对活性为1.0，对3-苯基异丝氨酰辅酶A为0.4，而对α-苯丙氨酰辅酶A等几乎无活性。BAPT的鉴定补全了紫杉醇生物合成所需的五个酰基/芳基转移酶基因，证实了β-苯丙氨酸直接转移至巴卡亭III的侧链装配途径，为利用异源表达系统提高紫杉醇产量及创制结构多样的紫杉醇类似物提供了关键的酶学基础和基因资源。
创新点
首次克隆并鉴定了BAPT，补全了紫杉醇生物合成所需的五个酰基/芳基转移酶基因；揭示了该酶对β-苯丙氨酰辅酶A的偏好性，并推测其催化机理中的组氨酸替代
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 紫杉醇生物合成 | TAX7 (BAPT) | baccatin III:3-氨基-3-苯基丙酰转移酶 | 催化 | 催化baccatin III C-13位选择性酰化，以β-苯丙氨酰辅酶A为酰基供体 |
关键发现
从东北红豆杉（Taxus cuspidata）cDNA文库中分离到编码C-13 O-苯丙丙酰转移酶的cDNA克隆TAX7（BAPT）。重组酶以baccatin III和β-苯丙氨酰辅酶A为底物，选择性催化baccatin III的13-O-酰化，生成N-去苯甲酰基-2'-脱氧紫杉醇。该cDNA全长1335 bp，编码445个氨基酸，计算分子量50,546。动力学参数：baccatin III的Km为2.4±0.5 μM，β-苯丙氨酰辅酶A的Km为4.9±0.3 μM。pH最适值为6.8。该酶对β-苯丙氨酰辅酶A的相对活性(Vrel)为1.0，对3-苯基异丝氨酰辅酶A为0.4，对α-苯丙氨酰辅酶A和N-Bz苯基异丝氨酰辅酶A<0.01。产物经化学N-苯甲酰化后经NMR和MS鉴定为2'-脱氧紫杉醇。
研究结论
BAPT的鉴定补全了紫杉醇生物合成所需的五个酰基/芳基转移酶基因，支持了β-苯丙氨酸作为侧链前体直接转移至baccatin III的途径，为通过异源表达提高紫杉醇产量及制备新一代紫杉醇类似物提供了基础。