Taxol biosynthesis: Molecular cloning of a benzoyl-CoA:taxane 2α-O-benzoyltransferase cDNA from Taxus and functional expression in Escherichia coli
- 作者
- Kevin Walker, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, WA 99164-6340
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2000）
- DOI
- 10.1073/pnas.250491997
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并功能鉴定紫杉醇生物合成途径中催化 C2α-羟基苯甲酰化的苯甲酰辅酶A:紫杉烷 2α-O-苯甲酰转移酶（TBT）。
研究策略
基于同源序列的 PCR 克隆策略，从甲基茉莉酸酯诱导的 Taxus cuspidata 细胞 cDNA 文库中筛选酰基转移酶基因，并在大肠杆菌 JM109 中异源表达，以半合成底物 2-脱苯甲酰-7,13-二乙酰巴卡亭 III 进行功能筛选和产物鉴定。
核心内容
该研究从经甲基茉莉酸酯诱导的紫杉（Taxus cuspidata）细胞cDNA文库中，采用同源序列PCR策略克隆了编码紫杉烷2α-O-苯甲酰转移酶（TBT）的cDNA（GenBank AF297618），其开放阅读框长1320 bp，编码440个氨基酸残基、分子量约50 kDa的蛋白。将TBT在大肠杆菌JM109中异源表达，以半合成底物2-脱苯甲酰-7,13-二乙酰巴卡亭III和苯甲酰-CoA进行功能筛选，经放射-HPLC、LC-MS和1H-NMR确认产物为7,13-二乙酰巴卡亭III。酶学表征显示，该酶最适pH为8.0，对紫杉烷底物和苯甲酰-CoA的Km分别为0.64 mM和0.30 mM，且对乙酰-CoA的相对活性仅为苯甲酰-CoA的约1.5%。该酶严格区域选择性催化C2α-羟基苯甲酰化，不能作用于1β、7β、10β、13α-羟基及其他紫杉二烯二醇位点。该酶的克隆完成了紫杉醇生物合成中TAT、TBT、DBAT三个酰基转移酶基因的鉴定，为紫杉醇产量提升和C2位取代类似物的酶促半合成提供了关键工具。
创新点
首次克隆了紫杉烷 2α-O-苯甲酰转移酶（TBT）cDNA；利用半合成底物实现功能鉴定；证明该酶对 C2α-羟基具有严格区域选择性；为紫杉醇类似物的酶促半合成提供了新工具。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | Taxol 生物合成途径 | tbt (GenBank AF297618) | taxane 2α-O-benzoyltransferase (TBT) | 催化 | 从 Taxus cuspidata 克隆，在大肠杆菌中异源表达，催化 2-脱苯甲酰-7,13-二乙酰巴卡亭 III 的 C2α-羟基苯甲酰化生成 7,13-二乙酰巴卡亭 III |
| Taxus cuspidata | Taxol 生物合成途径 | TAT (taxadien-5α-ol O-acetyltransferase) | taxadien-5α-ol O-acetyltransferase | 催化 | 紫杉醇生物合成中第一个酰化酶（已克隆），用于同源克隆 TBT 的参考 |
| Taxus cuspidata | Taxol 生物合成途径 | DBAT (10-deacetylbaccatin III 10-O-acetyltransferase) | 10-deacetylbaccatin III 10-O-acetyltransferase | 催化 | 紫杉醇生物合成中第三个酰化酶（已克隆），用于同源克隆 TBT 的参考 |
关键发现
- 成功从 Taxus cuspidata 中克隆编码紫杉烷 2α-O-苯甲酰转移酶（TBT）的 cDNA（GenBank AF297618），开放阅读框长 1320 bp，编码 440 个氨基酸残基的蛋白，分子量 50,089。重组酶在大肠杆菌 JM109 中功能性表达，以 2-脱苯甲酰-7,13-二乙酰巴卡亭 III 和苯甲酰-CoA 为底物生成 7,13-二乙酰巴卡亭 III，产物经放射-HPLC（保留时间
- 9±0.1 min）、LC-MS（保留时间
- 6±0.1 min）和 1H-NMR 确认。酶最适 pH 为
- 0；对紫杉烷底物的 Km 为
- 64 mM，对苯甲酰-CoA 的 Km 为
- 30 mM；对乙酰-CoA 的相对活性仅为苯甲酰-CoA 的约
- 5%。该酶不能苯甲酰化 10-去乙酰巴卡亭 III 的 1β、7β、10β、13α-羟基，也不能苯甲酰化简单紫杉二烯二醇的 2α 或 5α-羟基，显示严格区域选择性。化学合成中，7,13-二乙酰巴卡亭 III 产率 91%（纯度 99%），2-脱苯甲酰-7,13-二乙酰巴卡亭 III 产率 42%（纯度 99%）。
研究结论
本研究成功克隆并功能表达了紫杉醇生物合成途径中的紫杉烷 2α-O-苯甲酰转移酶（TBT），证实其催化 C2α-羟基的苯甲酰化。该酶的获得完成了紫杉醇生物合成中三个酰基转移酶基因（TAT、TBT、DBAT）的鉴定，为紫杉醇产量提高、途径解析及 C2 位取代类似物的酶促半合成奠定了基础。