Membrane-Inlet Mass Spectrometry Enables a Quantitative Understanding of Inorganic Carbon Uptake Flux and Carbon Concentrating Mechanisms in Metabolically Engineered Cyanobacteria
- 作者
- Damien Douchi, Feiyan Liang, Melissa Cano, Wei Xiong, Bo Wang, Pin-Ching Maness, Peter Lindblad, Jianping Yu
- 单位
- Biosciences Center, National Renewable Energy Laboratory; Microbial Chemistry, Department of Chemistry-Ångström, Uppsala University
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2019）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2019.01356
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏能够同时定量区分蓝藻无机碳（Ci）浓缩机制（CCM）与碳固定（CBB循环）活性的实时在体验证方法，导致对工程菌株碳利用能力的理解不精确。
研究策略
应用膜进样质谱（MIMS）实时监测培养液中无机碳浓度随时间的变化，通过Hill方程拟合Ci摄取速率—Ci浓度曲线，并定义碳固定系数（高Ci端最大值）和CCM系数（低Ci端20-25 μM区间斜率），从而分别量化碳固定与CCM活性；结合CBB循环抑制剂、高Ci驯化、光强改变及fbaA过表达菌株进行验证。
核心内容
该研究建立了一种基于膜进样质谱（MIMS）的实时定量方法，用于区分蓝藻胞外无机碳（Ci）的浓缩机制（CCM）活性与卡尔文-本森-巴沙姆（CBB）循环的碳固定活性。通过实时监测培养液中Ci浓度变化，利用Hill方程拟合Ci摄取速率与浓度的关系曲线，定义碳固定系数（高Ci端最大值）和CCM系数（低Ci端20–25 μM区间斜率）作为两个独立的量化指标。在集胞藻PCC 6803中过表达fbaA基因增强CBB循环后，倍增时间从6.5小时缩短至6.0小时，叶绿素含量增加20%，Ci固定系数和CCM系数均提高约14%；在乙醇生产菌株中，fbaA过表达使乙醇产量近乎翻倍，并将CCM系数提高10%、Ci固定系数提高7%。高光（750 μE m⁻² s⁻¹）使Ci固定增强60%、CCM增强45%，而CBB循环抑制剂乙醇醛仅降低高Ci端摄取速率35%而不影响低Ci端。结果表明，CBB循环代谢与CCM调控存在体内关联，该双系数方法为工程蓝藻碳利用效率的优化提供了新的检测工具和设计思路。
创新点
建立了基于MIMS的双系数定量方法，可在单一实验中区分并量化Ci固定与CCM活性；首次在体内证明fbaA过表达增强CBB循环可同时上调CCM和Ci固定；方法可用于代谢通量分析的约束。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 无机碳浓缩机制（CCM） | — | BicA | 转运 | 钠/碳酸氢盐共转运蛋白，由钠梯度驱动 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 无机碳浓缩机制（CCM） | sbtA | SbtA | 转运 | 钠/碳酸氢盐共转运蛋白，高亲和力 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 无机碳浓缩机制（CCM） | ndhD3, ndhD4 | NdhD3/D4 | 转运 | 推测参与钠梯度再生，由NADPH或铁氧还蛋白驱动 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 无机碳浓缩机制（CCM） | bct1 | Bct1 | 转运 | 具有自身ATP酶活性的碳酸氢盐转运复合体 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 无机碳浓缩机制（CCM） | ndh1-3, ndh1-4 | NDH1-3/NDH1-4 | 催化 | CO2摄取系统，将CO2转化为碳酸氢盐 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Calvin-Benson-Bassham循环 | fbaA | 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FbaA） | 催化 | 催化E4P+DHAP生成SBP及G3P+DHAP生成FBP，过表达提高Ci固定和CCM |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | Calvin-Benson-Bassham循环 | rbcL/rbcS | RubisCO | 催化 | 固定CO2的关键酶，位于羧酶体 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 无机碳浓缩机制（CCM） | — | 碳酸酐酶 | 催化 | 羧酶体中催化HCO3-与CO2互变 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 乙醇合成 | pdc, adh | 丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶 | 催化 | 来自运动发酵单胞菌，用于乙醇生产 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 光合电子传递链 | — | 光合电子传递链（PETC） | 能量供给 | 提供CCM和CBB循环所需的NADPH和ATP |
关键发现
- fbaA过表达菌株相较于野生型，倍增时间从6.5 h缩短至6.0 h（约10%缩短），叶绿素含量增加20%，净O2释放速率增加21%
- Ci固定系数和CCM系数均提高约14%。在乙醇生产菌株中，单独表达乙醇途径基因对Ci摄取和固定动力学无显著影响，但fbaA过表达使乙醇产量近乎翻倍，并将生长速率从8.6 h恢复至7.1 h，同时CCM系数提高10%、Ci固定系数提高7%。高光（750 μE m-2 s-1）相对200 μE m-2 s-1使Ci固定增强60%、CCM增强45%。高Ci驯化48 h后，Ci固定系数下降25%，CCM系数下降37%
- 8 h时Ci固定系数下降19%，CCM系数刚开始下降。CBB循环抑制剂乙醇醛（5 mM）使高Ci端摄取速率降低35%，但不影响低Ci端。
研究结论
MIMS方法能够实时、定量地分别反映Ci浓缩（CCM）与Ci固定（CBB循环）活性，且遗传改造CBB循环（如fbaA过表达）可同时刺激Ci摄取和固定，表明CBB代谢与CCM调控之间存在体内关联，为工程蓝藻提高碳利用效率提供了新策略和检测工具。