Eat1-Like Alcohol Acyl Transferases From Yeasts Have High Alcoholysis and Thiolysis Activity
- 作者
- Constantinos Patinios, Lucrezia Lanza, Inge Corino, Maurice C. R. Franssen, John Van der Oost, Ruud A. Weusthuis, Servé W. M. Kengen
- 单位
- Laboratory of Microbiology, Department of Agrotechnology and Food Sciences, Wageningen University and Research; Laboratory of Bioprocess Engineering, Department of Agrotechnology and Food Sciences, Wageningen University and Research; Laboratory of Organic Chemistry, Department of Agrotechnology and Food Sciences, Wageningen University and Research
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2020）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2020.579844
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示酵母Eat1酶是否具有醇解（alcoholysis）和硫解（thiolysis）活性，以及这些活性在体内外对酯类生成的影响。
研究策略
通过体外酶活测定（4-硝基苯酚释放法、GC产物分析）、不同酵母野生株和工程菌株（酿酒酵母、丙酮丁醇梭菌）的体内验证，以及不同醇/硫醇和酰基供体底物特异性分析，系统表征Eat1的醇解与硫解催化能力。
核心内容
该研究系统揭示了酵母来源的Eat1类醇酰基转移酶具有显著的醇解和硫解活性，而不仅是已知的AAT和酯酶功能。作者以Wickerhamomyces anomalus的WanEat1为代表，通过4-硝基苯酚释放法和GC产物分析进行体外酶活测定，并在多种野生酵母、酿酒酵母及丙酮丁醇梭菌中开展体内验证。结果发现，以乙酸乙酯和1-丙醇为底物时，WanEat1的醇解比活（7.56 U/mg）约为其乙酰CoA/乙醇AAT活性（0.017 U/mg）的445倍；以4-硝基苯乙酯为酰基供体时，10 mM乙醇下比活达124.30 U/mg。Eat1可接受C2-C10醇类，但酰基供体仅限于C2-C4酯。在C. beijerinckii中过表达WanEat1并添加50 mM乙酸乙酯，96小时产生16.92 mM乙酸丁酯，展示了将低值乙酯升级为高值丁酯的潜力。此外，Eat1也具备硫解活性，但高浓度醇或硫醇会不可逆抑制其活性。这项工作揭示了食品发酵中酯类生成的一条新途径，并为利用醇解反应进行酯类升级提供了酶学基础。
创新点
首次证明Eat1不仅具有AAT、酯酶和硫酯酶活性，还兼具高醇解活性和硫解活性；证明醇解活性远高于AAT活性；开发了利用Eat1醇解活性在Clostridium beijerinckii中将乙酯升级为丁酯的新策略。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Wickerhamomyces anomalus | 酯合成（醇解/硫解/AAT） | Eat1 (WanEat1, XP_019041020.1) | Eat1 alcohol acyl transferase | 催化 | 本研究的核心酶，纯化后测定其醇解、硫解等活性；在酿酒酵母中过表达最高产0.21 mM丁酸乙酯 |
| Saccharomyces cerevisiae | 酯合成（醇解） | EAT1 (YGR015C) 及多种Eat1同源基因 | Eat1同源酶（SceEat1等） | 催化 | 作为底盘细胞过表达不同Eat1同源物，验证体内醇解活性；空载体对照几乎不产丁酸乙酯 |
| Kluyveromyces marxianus | 酯合成（醇解） | Eat1 (KMAR_10772) | KmaEat1 | 催化 | 野生株在含丁酸丁酯时体内醇解产丁酸乙酯约<0.1 mM |
| Kluyveromyces lactis | 酯合成（醇解） | Eat1 (KLLA0_E24421g) | KlaEat1 | 催化 | 野生株醇解活性低，但在酿酒酵母中过表达后可催化丁酸乙酯生成 |
| Cyberlindnera jadinii | 酯合成（醇解） | Eat1 (CEP25158.1) | CjaEat1 | 催化 | 野生株在缺铁条件下与丁酸丁酯共培养产0.33 mM丁酸乙酯，过表达后也表现醇解活性 |
| Cyberlindnera fabianii | 酯合成（醇解） | Eat1 (CDR40574.1) | CfaEat1 | 催化 | 野生株产丁酸乙酯最高（0.42 mM），但过表达于酿酒酵母时醇解活性不高 |
| Hanseniaspora uvarum | 酯合成（醇解） | Eat1 (D499_0A01740) | HuvEat1 | 催化 | 野生株产0.14 mM丁酸乙酯，过表达时活性较高 |
| Wickerhamomyces ciferrii | 酯合成（醇解） | Eat1 (XP_011273049.1) | WciEat1 | 催化 | 野生株醇解产丁酸乙酯<0.1 mM，过表达于酿酒酵母后表现出醇解活性 |
| Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 | 酯合成（醇解/酯升级） | WanEat1（外源表达） | WanEat1 | 催化 | 过表达WanEat1并添加乙酸乙酯或丁酸乙酯，分别产乙酸丁酯16.92 mM和丁酸丁酯0.29 mM，用于低价值酯向高价值丁酯的升级 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 蛋白表达 | harmWanomala_5543-His (密码子协调的WanEat1) | 重组WanEat1-His | 催化 | 用于纯化WanEat1蛋白以进行体外酶活测定 |
关键发现
- 体外醇解活性是AAT活性的约445倍（以乙酸乙酯和1-丙醇为底物时比活7.56 U/mg vs 乙酰CoA/乙醇AAT 0.017 U/mg）
- 以4-硝基苯乙酯为酰基供体时，10 mM乙醇下比活达124.30±2.54 U/mg，5 mM 1-丁醇下100.49±0.27 U/mg，2.5 mM 1-己醇下60.25±0.88 U/mg
- Eat1可接受C2-C10的多种伯醇/仲醇，但酰基供体仅限于C2-C4（乙酸乙酯比活4.34±1.76 U/mg，丁酸乙酯1.70±0.43 U/mg，戊酸乙酯和己酸乙酯无活性）
- 高浓度醇或硫醇（>10 mM）不可逆抑制Eat1
- 体内醇解验证：野生酵母C. fabianii、C. jadinii和W. anomalus在含5 mM丁酸丁酯时分别产生0.42±0.05、0.33±0.01和0.32±0.02 mM丁酸乙酯
- 在酿酒酵母中过表达WanEat1产生0.21±0.01 mM丁酸乙酯
- 在C. beijerinckii中过表达WanEat1并添加50 mM乙酸乙酯，96 h产生16.92±0.58 mM乙酸丁酯
- 添加10 mM丁酸乙酯，72 h产生0.29±0.08 mM丁酸丁酯
- 硫解活性：乙硫醇存在下4-硝基苯酚释放比活40.04±2.36 U/mg（5 mM时），乙硫醇与乙酸乙酯生成硫代乙酸乙酯比活0.08±0.01 U/mg，但以硫代乙酸乙酯与乙醇进行醇解时比活达6.27±0.86 U/mg。
研究结论
Eat1是兼具醇解和硫解活性的多功能α/β-水解酶，其醇解活性在体外远高于AAT和酯酶活性，且体内多种酵母和工程菌中可发生醇解反应；该发现揭示了酿酒和食品发酵中酯类生成的另一重要途径，并为利用醇解活性升级低价值酯（如将乙酯转化为丁酯）提供了新策略。