Metabolic Engineering of Bacillus subtilis Toward Taxadiene Biosynthesis as the First Committed Step for Taxol Production
- 作者
- Ingy I. Abdallah, Hegar Pramastya, Ronald van Merkerk, Sukrasno, Wim J. Quax
- 单位
- Department of Chemical and Pharmaceutical Biology, Groningen Research Institute of Pharmacy, University of Groningen; Pharmaceutical Biology Research Group, School of Pharmacy, Institut Teknologi Bandung
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2019）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2019.00218
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在枯草芽孢杆菌中实现紫杉醇生物合成关键前体紫杉二烯的从头生产，解决天然提取效率低和化学合成复杂的问题。
研究策略
在Bacillus subtilis 168中表达来自红豆杉的紫杉二烯合酶（TXS），并过表达MEP途径八个酶（dxs, ispD, ispF, ispH, ispC, ispE, ispG, ispA）以及来自Pantoea ananatis的crtE基因（GGPPS），以增强GGPP前体供给，提高紫杉二烯产量。
核心内容
该研究以枯草芽孢杆菌168为宿主，首次在其中表达红豆杉来源的紫杉二烯合酶，并系统强化MEP途径和萜类前体供给，以实现紫杉醇关键中间体紫杉二烯的从头生物合成。研究者构建了含八个MEP途径基因及ispA的合成操纵子，同时引入来自Pantoea ananatis的crtE基因编码GGPPS，以增强GGPP前体供应。结果显示，仅表达紫杉二烯合酶时产量仅为0.024 mg/L/OD600；引入crtE后产量提升约20倍至0.471 mg/L/OD600；进一步过表达完整MEP途径和IspA、GGPPS后，产量达1.981 mg/L/OD600，总产量约17.8 mg/L，超过摇瓶条件下酵母和E. coli的报道水平。质粒稳定性实验表明关键质粒在30代后保持率在90%以上。该工作证明GGPPS过表达对补充GGPP前体至关重要，为利用枯草芽孢杆菌进行紫杉醇半合成生产奠定了工程基础。
创新点
首次在枯草芽孢杆菌中成功表达紫杉二烯合酶；构建包含完整MEP途径基因和ispA的合成操纵子；证明crtE编码的GGPPS对B. subtilis中GGPP前体供给至关重要；发现紫杉二烯可分泌至胞外并被十二烷层捕获。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (Dxs) | 催化 | MEP途径第一个酶，过表达以增加IPP/DMAPP供给 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispD | 2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶 (IspD) | 催化 | MEP途径酶，过表达 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispF | 2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 (IspF) | 催化 | MEP途径酶，过表达 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispH | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶 (IspH) | 催化 | MEP途径酶，过表达 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispC | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 (IspC/Dxr) | 催化 | MEP途径酶，过表达 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispE | 4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 (IspE) | 催化 | MEP途径酶，过表达 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispG | (E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶 (IspG) | 催化 | MEP途径酶，过表达 |
| Bacillus subtilis 168 | 萜类前体合成 | ispA | 香叶基焦磷酸合酶/法尼基焦磷酸合酶 (IspA) | 催化 | 同时具有GPPS和FPPS活性，负责合成GPP和FPP |
| Bacillus subtilis 168 | 萜类前体合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 (GGPPS) | 催化 | 来自Pantoea ananatis，负责将FPP转化为GGPP |
| Bacillus subtilis 168 | 紫杉二烯生物合成 | txs | 紫杉二烯合酶 (TXS) | 催化 | 来自Taxus baccata，截短去除前60个氨基酸（质体信号肽），将GGPP环化为taxa-4,11-diene |
| Bacillus subtilis 168 | 基因表达调控 | mntA RBS | — | 调控 | 利用B. subtilis mntA核糖体结合位点增强基因表达 |
| Bacillus subtilis 168 | 基因表达调控 | hyperspank promoter | — | 调控 | IPTG诱导型启动子控制txs表达 |
| Bacillus subtilis 168 | 基因表达调控 | xylose-inducible promoter (PspA) | — | 调控 | 木糖诱导启动子，控制crtE和MEP操纵子表达 |
关键发现
- 仅表达TXS的菌株紫杉二烯产量为0.024 mg/L/OD600
- 引入crtE后产量提高至0.471 mg/L/OD600（约20倍）
- 进一步过表达MEP途径和IspA、GGPPS后产量达1.981 mg/L/OD600（约83倍），总产量约17.8 mg/L
- 该产量高于酵母（8.7 mg/L）和E. coli（11.3 mg/L）摇瓶水平
- 质粒稳定性实验表明pDR_txs和pBSOE_crtE在30代后100%保持，p04_SDFHCEGA保持90%。
研究结论
成功在B. subtilis中表达TXS并显著提高紫杉二烯产量，证明GGPPS过表达对于补充GGPP前体是关键，该菌株可作为紫杉醇半合成生产进一步工程化的基础。