Application of valence and prospects for its production in engineered microorganisms
- 作者
- Yafeng Song, Huizhong Liu, Wim J. Quax, Zhiqing Zhang, Yiwen Chen, Ping Yang, Yinhua Cui, Qingshan Shi, Xiaobao Xie
- 单位
- Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Detection Center of Microbiology, Institute of Microbiology, Guangdong Academy of Sciences, Guangzhou, China; Department of Chemical and Pharmaceutical Biology, Groningen Research Institute of Pharmacy, University of Groningen, Groningen, Netherlands
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2024）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2024.1444099
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
瓦伦烯（valencene）是一种具有甜柑橘香气的倍半萜烯，传统上从柑橘果实中提取，但含量低（仅占0.2%-0.6%）且品质不稳定，难以满足市场需求，亟需开发可持续的微生物发酵生产方法。
研究策略
系统综述了瓦伦烯在植物中的生物合成途径、关键酶瓦伦烯合酶的研究进展，并重点总结了在细菌、真菌、微藻和植物等不同宿主中异源生产瓦伦烯的工程策略，包括MVA途径优化、区室化工程、酶工程、全局调控和发酵优化等。
核心内容
瓦伦烯是一种具甜柑橘香气的倍半萜烯，传统提取受限于柑橘中极低的含量（果皮仅12.84 mg/kg）和品质波动，难以满足市场需求。该文系统综述了瓦伦烯在植物中的生物合成途径及关键酶瓦伦烯合酶的研究进展，重点总结了在细菌、真菌、微藻等不同宿主中异源生产的工程策略，涵盖MVA途径优化、亚细胞区室化、酶工程、全局调控和发酵优化等。在酿酒酵母中，通过对来自冰河刺芹的瓦伦烯合酶进行多点突变，产量从78.9 mg/L提升至248 mg/L，进一步耦合细胞生长与途径诱导后，15 L生物反应器中产量达16.6 g/L，细胞干重超过100 g/L；利用Haloarchaea型非经典MVA途径和过氧化物酶体区室化策略，产量可达869 mg/L。此外，Rhodobacter sphaeroides在低密度培养下达354 mg/L，而Ustilago maydis中仅5.5 mg/L，显示宿主选择对产量影响显著。该综述表明，通过多策略组合，瓦伦烯产量已从毫克/升级提升至克/升级，微生物发酵是实现其可持续生产的有效途径，未来可通过动态代谢调控和底物利用优化进一步推动工业化。
创新点
全面梳理了瓦伦烯合酶的类型与工程改造（如EgVS突变体使产量提高3.15倍），率先系统总结了在酵母中利用非经典MVA途径（如Haloarchaea型）和过氧化物酶体区室化生产瓦伦烯的策略，并提出了将细胞生长与产物合成耦合以解决长期发酵中菌株退化问题的方法。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | tHMG1 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR） | 催化 | 截短型HMGR过表达，消除反馈抑制，增强MVA途径通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径/类异戊二烯前体合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶（FPPS） | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成FPP，过表达或与瓦伦烯合酶融合可提高产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | IDI1 | 异戊烯基焦磷酸异构酶（Idi） | 催化 | 催化IPP异构化为DMAPP，平衡前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成（竞争通路） | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 催化 | 下调表达以减少FPP流向角鲨烯，提高瓦伦烯前体可用性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 法尼醇合成支路 | DPP1 | 二酰甘油焦磷酸磷酸酶 | 催化 | 编码FPP转化为法尼醇的酶，敲除或替换可增加瓦伦烯产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 泛醌合成支路 | BTS1 | 香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPPS） | 催化 | 利用FPP合成GGPP，竞争前体，基因敲除或替换可提高瓦伦烯产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 瓦伦烯合成 | EgVS | 瓦伦烯合酶（来自Eryngium glaciale） | 催化 | 突变体（I533V, R336K, H196R, D176E, R306K, K325E）使产量提高3.15倍，主产物/副产物比从2.97:1升至4.18:1 |
| Saccharomyces cerevisiae | 瓦伦烯合成 | CnVS | 瓦伦烯合酶（来自Callitropsis nootkatensis） | 催化 | 密码子优化后整合多拷贝，与ERG20融合，显著提高产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 瓦伦烯合成 | CsTPS1 | 瓦伦烯合酶（来自Citrus sinensis） | 催化 | 靶向线粒体表达提高产量，与FDPS共靶向时增产8倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径调控 | ROX1 | 转录因子Rox1 | 调控 | 抑制缺氧诱导的MVA途径基因表达，敲低可提高瓦伦烯产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | GAL调控系统 | GAL80 | 转录调控因子Gal80 | 调控 | 敲除GAL80以解除对GAL启动子的抑制，提高瓦伦烯合酶表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 过氧化物酶体区室化 | PEX28 | 过氧化物酶体膜蛋白Pex28p | 区室化 | 过表达增加过氧化物酶体数量，使瓦伦烯产量提高50% |
| Saccharomyces cerevisiae | 线粒体区室化 | — | 线粒体靶向信号肽 | 区室化 | 利用线粒体靶向信号肽将CsTPS1和FDPS导入线粒体，利用高浓度乙酰-CoA提高瓦伦烯产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 非经典MVA途径（Haloarchaea型） | — | Haloarchaea型MVA途径酶 | 催化 | 在过氧化物酶体中重构非经典MVA途径，经优化后产量达869 mg/L |
| Yarrowia lipolytica | MVA途径 | CnVS | 瓦伦烯合酶（来自Callitropsis nootkatensis） | 催化 | 过表达CnVS及HMG、ERG12、ERG20、IDI等基因，玻璃管培养产量113.9 mg/L |
| Pichia pastoris | MVA途径 | CnVS | 瓦伦烯合酶（来自Callitropsis nootkatensis） | 催化 | 过表达瓦伦烯合酶及前体相关酶，摇瓶产量166 mg/L（注：原始文献主要生产nootkatone） |
| Schizophyllum commune | MVA途径 | CnVS | 瓦伦烯合酶（来自Callitropsis nootkatensis） | 催化 | 敲除thn基因减少schizophyllan分泌，产量提升4倍达16 mg/L |
| Ustilago maydis | MVA途径 | CnVS | 瓦伦烯合酶（来自Callitropsis nootkatensis） | 催化 | 以GFP融合形式表达增强胞质定位，摇瓶产量5.5 mg/L |
| Rhodobacter capsulatus | 内源MEP途径 + 异源MVA途径 | CnVS | 瓦伦烯合酶（来自Callitropsis nootkatensis） | 催化 | 过表达IspA和质粒MVA模块，产量提高147倍后达18 mg/L（5天培养） |
| Rhodobacter sphaeroides | 内源MEP途径 + 异源MVA途径 | CnVS | 瓦伦烯合酶（MBP融合，来自Callitropsis nootkatensis） | 催化 | 共表达密码子优化的CnVS和甲羟戊酸操纵子，低细胞密度摇瓶培养3天产量354 mg/L |
关键发现
- 瓦伦烯市场价值预计2033年达920万美元
- 柑橘果皮中瓦伦烯含量为12.84 mg/kg，远高于果肉（0.08 mg/kg）
- 乙烯处理使瓦伦烯产量增加20%以上，瓦伦烯合酶转录水平提高8倍
- 酿酒酵母中通过EgVS突变（I533V, R336K, H196R, D176E, R306K, K325E）使瓦伦烯产量从78.9 mg/L提高至248 mg/L，进一步耦合细胞生长与途径诱导后，15 L生物反应器中产量达16.6 g/L（120 h，细胞干重>100 g/L）
- 在酿酒酵母中组合多种策略（密码子优化CnVS、增强MVA途径、补料分批发酵）使产量达1.2 g/L
- 利用Haloarchaea型MVA途径和过氧化物酶体区室化，产量达869 mg/L
- 以甘露醇为底物并通过高密度发酵产量达5.6 g/L
- Rhodobacter sphaeroides在低细胞密度培养下产量达354 mg/L
- Rhodobacter capsulatus经147倍提高后产量仅18 mg/L
- Ustilago maydis中产量为5.5 mg/L
- Schizophyllum commune中敲除thn基因后产量提升4倍达16 mg/L。
研究结论
瓦伦烯具有广泛的应用前景，微生物发酵是实现其可持续生产的有效途径。通过MVA途径优化、关键酶工程改造、亚细胞区室化、全局调控及发酵过程优化等策略，瓦伦烯产量已从毫克/升级提升至克/升级（最高16.6 g/L）。未来可通过工程底物利用、优化辅因子供给、实施动态代谢调控以及调节细胞疏水性等方向进一步提升产量，推动工业化应用。