A New Type of Asymmetrically Acting β -Carotene Ketolase Is Required for the Synthesis of Echinonene in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
- 作者
- Blanca Fernández-González, Gerhard Sandmann, Agustin Vioque
- 单位
- Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla-CSIC, Americo Vespucio s/n, 41092 Sevilla, Spain; Botanisches Institut, Biosynthesis Group, Postfach 111932, D-60054 Frankfurt, Germany
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（1997）
- DOI
- 10.1074/jbc.272.15.9728
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定 Synechocystis sp. PCC 6803 中合成海胆酮（echinenone）所需的酶，该酶与已知细菌型胡萝卜素脱氢酶同源但功能未知，并验证其是否负责海胆酮的生物合成。
研究策略
基于全基因组序列预测 ORF slr0088，通过在大肠杆菌中异源共表达不同类胡萝卜素合成基因，检测其催化功能；利用体外酶活测定验证β-胡萝卜素酮醇酶活性；并通过基因敲除确认其在集胹藻中合成海胆酮的必要性。
核心内容
该研究通过基因组预测、异源表达、体外酶活测定和基因敲除等手段，鉴定了集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803中负责海胆酮生物合成的新型β-胡萝卜素酮醇酶。研究基于全基因组序列锁定ORF slr0088（命名为crtO），将其在大肠杆菌中与β-胡萝卜素积累菌株共表达，发现其能催化β-胡萝卜素仅在一个β-紫罗兰酮环上引入酮基生成海胆酮，并伴随少量角黄素。体外实验表明，含CrtO的粗提物可将β-胡萝卜素转化为海胆酮，转化率为12%，角黄素为2%，且反应依赖NADPH。敲除crtO的突变株完全检测不到海胆酮，而其他类胡萝卜素水平正常，证实该酶是体内合成海胆酮的必要组分；突变株在低光和高光下的生长及光合放氧均与野生型无显著差异。序列分析显示CrtO与已知对称型酮醇酶CrtW无同源性，反而更接近细菌型八氢茄红素脱氢酶，提示其具有独特的不对称催化机制。该发现为类胡萝卜素生物合成提供了新型酶工具，拓展了对该类酶家族进化与功能多样性的认识。
创新点
发现了一种与已知对称型β-胡萝卜素酮醇酶（CrtW）无同源性的新型不对称酮醇酶 CrtO，它催化β-胡萝卜素仅在一个β-紫罗兰酮环上引入酮基生成海胆酮；该酶在进化上更接近细菌型胡萝卜素脱氢酶，可能具有独特的反应机制。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 类胡萝卜素生物合成 | crtO (slr0088) | CrtO | 催化 | 不对称β-胡萝卜素酮醇酶，将β-胡萝卜素转化为海胆酮；基因敲除后海胆酮消失。 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成（异源表达） | crtO | CrtO | 催化 | 在积累β-胡萝卜素的大肠杆菌中表达，产生海胆酮和少量角黄素；体外转化率 12%。 |
关键发现
- slr0088（crtO）编码 59 kDa 蛋白，在大肠杆菌中表达后，与积累β-胡萝卜素的菌株共培养产生海胆酮和少量角黄素，证明其为β-胡萝卜素酮醇酶
- 体外实验显示，含crtO的大肠杆菌粗提物将β-胡萝卜素转化为海胆酮的转化率为 12%，角黄素为 2%，且需要 NADPH
- 敲除 crtO 的 Synechocystis 突变株中检测不到海胆酮，而其他类胡萝卜素（如β-胡萝卜素、玉米黄质、蓝藻叶黄素）水平正常
- crtO 突变株在低光（50 μE m-2 s-1）和高光（250 μE m-2 s-1）下生长速率和光合放氧与野生型无显著差异
- crtO 蛋白序列与已知对称酮醇酶无相似性，但与细菌型八氢茄红素脱氢酶有同源性。
研究结论
crtO 基因编码一种新型不对称β-胡萝卜素酮醇酶，它催化β-胡萝卜素生成海胆酮，是集胹藻合成海胆酮所必需的。该酶与已知对称酮醇酶在结构和催化特性上明显不同，为类胡萝卜素工程提供了新的工具。