Enzymology: In Vitro Characterization of Astaxanthin Biosynthetic Enzymes
- 作者
- Paul D. Fraser, Yutaka Miura, Norihiko Misawa
- 单位
- Central Laboratories for Key Technology, Kirin Brewery Co., Ltd., Kanazawa-ku, Yokohoma-shi, Kanagawa 236, Japan
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（1997）
- DOI
- 10.1074/jbc.272.10.6128
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
虾青素生物合成关键酶（CrtZ、CrtW、BKT）缺乏体外酶学表征，底物偏好、辅因子需求及催化机制不明。
研究策略
在大肠杆菌中异源表达来自海洋细菌（Agrobacterium aurantiacum、Alcaligenes sp. PC-1）、Haematococcus pluvialis和Erwinia uredovora的虾青素生物合成基因，制备粗酶提取物，以β-胡萝卜素、角黄素、玉米黄素为底物进行体外酶活测定，分析产物组成、辅因子依赖性及底物选择性。
核心内容
该研究对虾青素生物合成关键酶进行了系统的体外酶学表征。研究将来自海洋细菌（Agrobacterium aurantiacum、Alcaligenes sp. PC-1）、Haematococcus pluvialis 和 Erwinia uredovora 的 crtZ、crtW 和 bkt 基因在大肠杆菌中异源表达，制备粗酶提取物后以β-胡萝卜素、角黄素和玉米黄素为底物测定酶活。结果表明所有 CrtZ 均为双功能酶，可催化β-胡萝卜素经β-隐黄质生成玉米黄质，或催化角黄素经 phoenicoxanthin 生成虾青素；CrtW/BKT 同样为双功能酶，催化β-胡萝卜素经 echinenone 生成角黄素，或催化玉米黄质生成4-酮玉米黄质并伴随痕量虾青素。酶活测定显示 A. aurantiacum CrtZ 催化角黄素转化为虾青素的活性达 60±8.0 pmol/h/mg 蛋白，约为其催化β-胡萝卜素转化活性的36倍，而 Erwinia CrtZ 则偏好β-胡萝卜素途径。反应严格依赖氧气，厌氧条件下 CrtW 活性被抑制96%-100%，Fe2+、2-氧代戊二酸、抗坏血酸和过氧化氢酶组合对活性有益。体外酶活速率约为体内速率的46%-47%。基于酶学数据，研究提出海洋细菌中虾青素生物合成的优先途径为β-胡萝卜素→echinenone→角黄素→phoenicoxanthin→虾青素，并建议将 CrtZ 和 CrtW/BKT 分别命名为类胡萝卜素 3,3'-β-紫罗兰酮环羟化酶和 4,4'-β-紫罗兰酮环加氧酶。该工作首次阐明了这些酶的催化机制和底物偏好性，为虾青素的异源生物合成提供了重要的酶学基础。
创新点
['首次对海洋细菌CrtZ和CrtW酶进行体外酶学表征', "证明CrtZ和CrtW/BKT酶均为双功能酶，分别作用于β-紫罗兰酮环的3,3'位和4,4'位", '确定酶促反应严格依赖氧气，且Fe2+、2-氧代戊二酸、抗坏血酸和过氧化氢酶组合对活性有益', '根据酶学数据提出虾青素生物合成优先途径，并建议新的酶命名']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | 虾青素生物合成 | crtZ | CrtZ (A. aurantiacum) | 催化 | 来自海洋细菌Agrobacterium aurantiacum，催化β-胡萝卜素3,3'位羟化和角黄素3,3'位羟化；质粒pAK96NK |
| Escherichia coli JM109 | 虾青素生物合成 | crtZ | CrtZ (Alcaligenes sp. PC-1) | 催化 | 来自Alcaligenes sp. strain PC-1，催化β-胡萝卜素和角黄素的羟化；质粒pPC13 |
| Escherichia coli JM109 | 虾青素生物合成 | crtZ | CrtZ (Erwinia uredovora) | 催化 | 来自Erwinia uredovora，催化β-胡萝卜素和角黄素的羟化；质粒pCRT-Z |
| Escherichia coli JM109 | 虾青素生物合成 | crtW | CrtW (A. aurantiacum) | 催化 | 来自Agrobacterium aurantiacum，催化β-胡萝卜素和玉米黄质的4,4'位酮基化；质粒pAK916 |
| Escherichia coli JM109 | 虾青素生物合成 | crtW | CrtW (Alcaligenes sp. PC-1) | 催化 | 来自Alcaligenes sp. strain PC-1，催化β-胡萝卜素和玉米黄质的4,4'位酮基化；质粒pPC17-3 |
| Escherichia coli JM109 | 虾青素生物合成 | bkt | BKT (Haematococcus pluvialis) | 催化 | 来自Haematococcus pluvialis，催化β-胡萝卜素和玉米黄质的4,4'位酮基化；质粒pUCBKT |
关键发现
- 所有CrtZ酶均能催化β-胡萝卜素经β-隐黄质生成玉米黄质，以及角黄素经phoenicoxanthin生成虾青素
- CrtW/BKT酶能催化β-胡萝卜素经echinenone生成角黄素，及玉米黄质生成4-酮玉米黄质并伴有痕量虾青素。最大催化活性：A. aurantiacum CrtZ催化β-胡萝卜素→玉米黄质为9±1.0 pmol/h/mg蛋白，角黄素→虾青素为60±8.0
- Alcaligenes PC-1 CrtZ分别为3.4±0.9和28±4.0
- Erwinia CrtZ分别为37±6.0和6±1.3。CrtW/BKT活性：A. aurantiacum CrtW催化β-胡萝卜素→角黄素为5±0.7，玉米黄质→4-酮玉米黄质为12±2.0
- H. pluvialis BKT为5±1.0和10±3.0
- Alcaligenes PC-1 CrtW为12±3.0和9±3.0。体内类胡萝卜素合成速率：玉米黄质5.3±1.9、角黄素1.8±0.2、虾青素2.95±0.95、海洋细菌3.1±0.7 μg/g干重/h
- 体外CrtZ和CrtW/BKT速率分别约为2.5和0.83 μg/g干重/h，分别为体内速率的47%和46%。厌氧条件下CrtZ催化β-胡萝卜素和角黄素转化活性分别被抑制76%和88%，CrtW催化β-胡萝卜素和玉米黄质转化分别被抑制96%和100%。底物选择实验显示，海洋细菌CrtZ偏好角黄素→虾青素（A. aurantiacum约36倍、Alcaligenes约6倍偏好），而Erwinia CrtZ偏好β-胡萝卜素→玉米黄质（约5倍）
- CrtW/BKT底物选择性较弱，受底物浓度变化影响显著。
研究结论
基于酶学数据，提出海洋细菌中虾青素生物合成的优先途径：β-胡萝卜素→echinenone→角黄素→phoenicoxanthin→虾青素；CrtZ和CrtW/BKT均为双功能酶，建议分别命名为类胡萝卜素3,3'-β-紫罗兰酮环羟化酶和类胡萝卜素4,4'-β-紫罗兰酮环加氧酶。