Carbohydrates, Lipids, and Other Natural Products: A cDNA Clone for Taxadiene Synthase, the Diterpene Cyclase That Catalyzes the Committed Step of Taxol Biosynthesis
- 作者
- Mark R. Wildung, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry and Department of Biochemistry and Biophysics, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6340
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（1996）
- DOI
- 10.1074/jbc.271.16.9201
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇生物合成关键酶紫杉二烯合酶（taxadiene synthase）因在天然组织中丰度低且不稳定而难以纯化，无法通过蛋白测序获取cDNA探针，因此需要基于同源序列的PCR策略克隆其cDNA。
研究策略
基于已知植物单萜、倍半萜和二萜环化酶的保守序列设计简并引物，通过PCR从太平洋紫杉茎cDNA文库中获得83 bp特异片段作为杂交探针，筛选全长cDNA克隆，并在大肠杆菌中异源表达验证功能。
核心内容
该研究首次克隆了紫杉醇生物合成关键酶紫杉二烯合酶（taxadiene synthase）的cDNA，并在大肠杆菌中实现了功能表达。由于该酶在天然组织中丰度低且不稳定，难以通过蛋白纯化获得序列信息，研究者依据已知植物萜类环化酶的保守序列设计简并引物，通过PCR从太平洋紫杉茎cDNA文库中获得83 bp特异片段，进而筛选出全长cDNA克隆。获得的cDNA全长2700 bp，开放阅读框2586 bp，编码862个氨基酸，预测分子量为98,303 Da。重组蛋白在大肠杆菌中能够催化香叶基香叶基焦磷酸转化为紫杉二烯，产物产量约1 nmol，经GC-MS确证。序列分析显示该酶与冷杉abietadiene synthase同源性最高，同一性46%、相似性67%。该工作绕过了传统蛋白测序的技术瓶颈，为后续通过强启动子驱动紫杉二烯合酶在Taxus细胞中过表达、提高紫杉醇及紫杉烷类产量奠定了分子基础，因为该环化步骤是紫杉醇生物合成途径中的潜在限速步骤。
创新点
首次克隆了紫杉二烯合酶cDNA并在大肠杆菌中实现功能表达；通过同源PCR策略克服了蛋白纯化困难，绕过了传统蛋白测序。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli XL1-Blue | 紫杉醇生物合成（二萜类） | taxadiene synthase (TXS) | 紫杉二烯合酶 | 催化 | 重组表达并验证催化geranylgeranyl diphosphate生成taxa-4(5),11(12)-diene |
| Taxus brevifolia | 紫杉醇生物合成（二萜类） | taxadiene synthase | 紫杉二烯合酶 | 催化 | 天然来源，从茎中提取RNA构建cDNA文库 |
关键发现
- 获得的cDNA全长2700 bp，开放阅读框2586 bp，编码862个氨基酸，预测分子量98,303 Da
- 重组蛋白可催化geranylgeranyl diphosphate转化为taxa-4(5),11(12)-diene，产物产量约1 nmol，经GC-MS确证
- 与冷杉abietadiene synthase同源性最高（46%同一性、67%相似性）。
研究结论
克隆的taxadiene synthase cDNA可用于后续通过强启动子驱动其在Taxus细胞中过表达，以提高紫杉醇及紫杉烷类产量，因为该环化步骤是途径中的慢步骤和潜在限速步骤。