Identification of a Novel Gene Cluster Participating in Menaquinone (Vitamin K2) Biosynthesis: CLONING AND SEQUENCE DETERMINATION OF THE 2-HEPTAPRENYL-1,4-NAPHTHOQUINONE METHYLTRANSFERASE GENE OF BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS
- 作者
- Ayumi Koike-Takeshita, Tanetoshi Koyama, Kyozo Ogura
- 单位
- Bio Research Laboratory, Toyota Motor Corporation; Department of Biochemistry and Engineering, Faculty of Engineering, Tohoku University; Institute for Chemical Reaction Science, Tohoku University
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（1997）
- DOI
- 10.1074/jbc.272.19.12380
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定嗜热脂肪芽孢杆菌中参与甲萘醌（维生素K2）生物合成的新基因簇，特别是编码2-heptaprenyl-1,4-naphthoquinone甲基转移酶的基因。
研究策略
基于序列同源性分析和甲基转移酶保守基序的预测，构建ORF-2表达载体，在E. coli中异源表达，并以放射性标记底物检测甲基转移酶活性；同时通过E. coli突变体互补实验确认相关基因功能。
核心内容
该研究从嗜热脂肪芽孢杆菌中鉴定并克隆了参与甲萘醌（维生素K2）生物合成的新型基因簇。通过序列同源性分析与甲基转移酶保守基序预测，研究者定位到ORF-2基因，其编码234个氨基酸、分子量27,132的多肽，与已知甲基转移酶GerC2、O251、UbiG等具有17%至69%不等的序列一致性。将该基因在大肠杆菌中异源表达后，粗提物能以S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移至2-octaprenyl-1,4-naphthoquinone生成MK-8，且产量随时间递增，表明该酶对异戊二烯侧链长度特异性不严格。该基因被命名为menG，位于heps-1和heps-2之间，三者构成新的甲萘醌生物合成基因簇。此外，大肠杆菌ubiE突变株AN70转入含o251的质粒后可在M9培养基上恢复生长，提示o251可能编码UbiE，并可能同时催化泛醌和甲萘醌生物合成中的相似甲基化反应。该工作首次阐明了甲萘醌生物合成末端甲基化步骤的遗传基础，为维生素K2的微生物合成提供了新靶点。
创新点
首次克隆并鉴定了甲萘醌生物合成末端甲基转移酶基因menG；发现heps-1、menG、heps-2构成新的参与甲萘醌生物合成的基因簇；通过序列相似性和互补实验提示E. coli的o251可能编码UbiE。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus stearothermophilus | menaquinone (维生素K2) 生物合成 | menG (ORF-2) | 2-heptaprenyl-1,4-naphthoquinone methyltransferase | 催化 | 催化2-heptaprenyl-1,4-naphthoquinone的SAM依赖性甲基化，为MK生物合成最后一步 |
| Bacillus stearothermophilus | menaquinone (维生素K2) 生物合成 | heps-1 (ORF-1) | heptaprenyl diphosphate synthase 组分1 | 催化 | 与heps-2编码的组分2共同构成HepPP合酶，催化IPP与FPP缩合生成HepPP |
| Bacillus stearothermophilus | menaquinone (维生素K2) 生物合成 | heps-2 (ORF-3) | heptaprenyl diphosphate synthase 组分2 | 催化 | HepPP合酶的另一个结构亚基，与heps-1共同发挥催化功能 |
| Escherichia coli | menaquinone/ubiquinone 生物合成 | o251 (候选ubiE) | UbiE | 催化 | 与MenG有37%序列一致性，互补实验表明可能编码UbiE，催化demethyl-MK和2-octaprenyl-6-methoxy-1,4-benzoquinone的甲基化 |
| Escherichia coli | ubiquinone 生物合成 | ubiG | UbiG | 催化 | 参与ubiquinone生物合成，与MenG有22%序列一致性，作为同源对照 |
关键发现
- ORF-2编码234个氨基酸的多肽，分子量为27,132
- 其氨基酸序列与GerC2、O251、UbiG、DauC、PmtA、COQ3的一致性分别为69%、37%、22%、27%、27%、17%。表达ORF-2的E. coli粗提物能以S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基转移至2-octaprenyl-1,4-naphthoquinone生成MK-8，且MK-8的生成随时间增加。E. coli ubiE突变株AN70转入含o251的质粒pO251后可在M9培养基上生长，而AN70不能，表明o251可能编码UbiE。
研究结论
Bacillus stearothermophilus的ORF-2编码2-heptaprenyl-1,4-naphthoquinone甲基转移酶，命名为menG，位于heps-1和heps-2之间，三者构成新的甲萘醌生物合成基因簇。该酶对prenyl侧链长度特异性不严格，可利用E. coli内源底物合成MK-8。此外，E. coli的o251可能编码UbiE，且UbiE可能同时催化ubiquinone和menaquinone生物合成中的类似甲基化反应。