Pleiotropic Effects of puf Interposon Mutagenesis on Carotenoid Biosynthesis in Rubrivivax gelatinosus: A NEW GENE ORGANIZATION IN PURPLE BACTERIA
- 作者
- Soufian Ouchane, Martine Picaud, Claudie Vernotte, Françoise Reiss-Husson, Chantal Astier
- 单位
- Centre de Génétique Moléculaire du CNRS (UPR 9061) Associé à l'Université Pierre et Marie Curie, Bâtiment 24, Avenue de la Terrasse, 91198 Gif sur Yvette Cedex, France
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（1997）
- DOI
- 10.1074/jbc.272.3.1670
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
阐明Rubrivivax gelatinosus中类胡萝卜素生物合成基因crtD和crtC的基因组定位、共转录机制及其在类胡萝卜素合成途径（含spirilloxanthin途径）中的功能。
研究策略
利用puf操纵子内的插入突变（interposon mutagenesis）和crtD基因失活，结合遗传分析、DNA序列测定、Southern blot、类胡萝卜素提取与吸收光谱/薄层色谱分析，研究crt基因的表达调控与功能。
核心内容
该研究通过puf操纵子内插入突变和crtD基因失活等策略，系统解析了紫色细菌Rubrivivax gelatinosus中类胡萝卜素生物合成基因的组织与调控机制。研究发现crtD和crtC基因位于puf操纵子下游并与之共转录，受氧调控的puf启动子驱动，这是首次在紫色细菌中发现此类基因布局。突变株因类胡萝卜素合成受阻而呈现绿色，其吸收峰由野生型的455、481、512 nm蓝移至约425、458、487 nm，主要积累neurosporene和lycopene。序列分析表明crtD长1572 bp，编码约56 kDa蛋白，crtC长1218 bp，编码约44 kDa蛋白，且两者起始密码子重叠372个核苷酸；CrtD与R. capsulatus相应蛋白相似性达53%，CrtC为42%。实验证实crtD和crtC同时参与spheroidene和spirilloxanthin两条合成途径，前者是首次在spirilloxanthin途径中鉴定的类胡萝卜素基因。该发现揭示了紫色细菌类胡萝卜素基因与光合基因协同表达的新模式，为理解该类代谢途径的进化与调控提供了关键依据。
创新点
首次在紫色细菌中发现crtD和crtC基因位于puf操纵子下游并与puf共转录；首次鉴定了参与spirilloxanthin生物合成途径的类胡萝卜素基因（crtC和crtD）；证明crtD和crtC同时参与spheroidene和spirilloxanthin两条途径。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rubrivivax gelatinosus strain S1 | 类胡萝卜素生物合成 | crtD | CrtD (3,4-脱氢酶) | 催化 | 参与spheroidene和spirilloxanthin途径；基因位于puf操纵子下游，长1572 bp，编码约56 kDa蛋白，与R. capsulatus CrtD相似性53%。 |
| Rubrivivax gelatinosus strain S1 | 类胡萝卜素生物合成 | crtC | CrtC (水合酶) | 催化 | 催化neurosporene水合及lycopene水合；基因与crtD重叠372 nt，长1218 bp，编码约44 kDa蛋白，与R. capsulatus CrtC相似性42%。 |
| Rubrivivax gelatinosus strain S1 | 光合作用 | pufB, pufA, pufL, pufM, pufC | LHI和RC亚基及细胞色素亚基 | 能量供给 | puf操纵子编码光捕获复合体B875和反应中心亚基；与类胡萝卜素基因crtD/crtC共转录，其启动子受氧调控。 |
关键发现
- puf操纵子缺失或插入突变导致细胞变绿，类胡萝卜素吸收峰从野生型的455、481、512 nm蓝移至约425（肩峰）、458、487 nm
- 突变株SIL1和SΔC1主要积累neurosporene和lycopene。crtD基因长1572 bp，编码约56 kDa蛋白
- crtC基因长1218 bp，编码约44 kDa蛋白，且crtC起始密码子与crtD基因重叠372个核苷酸。CrtD与R. capsulatus相应蛋白相似性为53%，CrtC为42%
- crtC基因前126个密码子第三位CG含量64%，其余部分为93%。在SID1（crtD::Ω）中积累neurosporene和lycopene，而SID2（crtD::Km）中积累neurosporene、methoxyneurosporene、hydroxyneurosporene、lycopene和rhodopin，证明crtD和crtC共转录。SIO菌株在光合条件下从绿色恢复为紫色，表明类胡萝卜素基因受氧调控的puf启动子驱动
- SIL2和SΔC2（Km插入无终止子）保持紫色，进一步支持共转录。
研究结论
在R. gelatinosus中，crtD和crtC基因位于puf操纵子下游并与之共转录，使用受氧调控的puf启动子；这两个基因同时参与spheroidene和spirilloxanthin两条类胡萝卜素生物合成途径，是首次在spirilloxanthin途径中鉴定的类胡萝卜素基因。