Physiological and Molecular Characterization of an Oxidative Stress-Resistant Saccharomyces cerevisiae Strain Obtained by Evolutionary Engineering
- 作者
- Nazli Kocaefe-Özgen, Bahtiyar Yilmaz, Ceren Alkim, Mevlüt Arslan, Alican Topaloğlu, Halil Ibrahim Kısakesen, Erdinç Gülsev, Z. Petek Çakar
- 单位
- Department of Molecular Biology and Genetics, Istanbul Technical University; Dr. Orhan Öcalgiray Molecular Biology, Biotechnology and Genetics Research Center (ITU-MOBGM), Istanbul Technical University
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2022）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2022.822864
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
氧化胁迫是工业酵母发酵中的常见胁迫因素，会降低酵母生长、存活率和产量，然而其复杂分子机制尚不明确，且缺乏通过进化工程获得的氧化胁迫抗性酿酒酵母菌株。
研究策略
采用三种进化工程策略（连续氧化胁迫、氧化脉冲预处理、热脉冲预处理）结合EMS随机诱变，筛选遗传稳定的氧化胁迫抗性菌株，并通过比较生理学、转录组（微阵列）和全基因组重测序分析揭示抗性机制。
核心内容
该研究针对工业酵母发酵中氧化胁迫导致生长和产量下降的问题，通过三种进化工程策略结合EMS随机诱变，从酿酒酵母CEN.PK 113-7D出发筛选遗传稳定的抗性菌株，并整合生理学、转录组与全基因组重测序解析抗性机制。结果显示，热脉冲预处理结合连续氧化胁迫的策略最优，获得的菌株H7在1 mM H2O2下最大比生长速率为0.30 h-1，约为参考菌株的2倍，且对热、冻融、乙醇及多种金属离子具有交叉抗性。机制层面，H7的特异性过氧化氢酶活性约为参考菌株的4倍，培养18小时时糖原和海藻糖含量分别高出17倍和10倍；转录组分析发现1911个ORFs差异表达，其中过氧化氢酶T编码基因CTT1上调5.37倍，大量Msn2/4调控的胁迫响应基因协同上调；基因组重测序共检测到33个错义突变、2个无义突变和1个移码缺失，突变富集于胁迫响应、细胞壁组织和碳水化合物代谢相关基因。该研究证明了热脉冲预处理可高效获得氧化胁迫抗性菌株，并揭示了多基因协同的复杂抗性机制，为工业酵母耐受性改造提供了靶点和策略参考。
创新点
首次通过进化工程获得氧化胁迫抗性酿酒酵母菌株并系统表征；比较了不同预处理策略的效果，发现热脉冲预处理策略最优；整合生理、转录组和基因组多组学分析，揭示了涉及过氧化氢酶、海藻糖/糖原积累、细胞壁完整性及多效胁迫响应基因的协同抗性机制。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D | 氧化胁迫响应 | CTT1 | 过氧化氢酶T (Catalase T) | 催化 | 编码胞质过氧化氢酶T，在H7菌株中上调5.37倍，增强H2O2分解能力 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D | 应激响应调控 | MSN2 | Msn2 | 调控 | 胁迫响应转录因子，调控大量环境胁迫响应基因的表达 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D | 应激响应调控 | MSN4 | Msn4 | 调控 | 胁迫响应转录因子，与Msn2协同调控胁迫应答基因 |
关键发现
- 通过热脉冲预处理策略获得菌株H7具有最高氧化胁迫抗性，且对热、冻融、乙醇、铁、钴和盐等胁迫具有交叉抗性
- 在1 mM H2O2下，H7的最大比生长速率为0.30 h-1（参考菌株为0.15 h-1），加倍时间为2.32 h（参考菌株为4.77 h）
- H7的特异性过氧化氢酶活性约为参考菌株的4倍
- 培养18小时时，H7的糖原和 trehalose 含量分别比参考菌株高17倍和10倍
- 转录组分析发现1911个ORFs差异表达（897个上调，1014个下调），其中CTT1（编码过氧化氢酶T）上调5.37倍，大量Msn2/4调控的胁迫响应基因上调
- 全基因组重测序检测到33个错义突变、2个无义突变、1个移码缺失、12个沉默突变和12个基因间突变。
研究结论
热脉冲预处理结合连续氧化胁迫的进化工程策略能够高效获得遗传稳定的氧化胁迫抗性酿酒酵母菌株。其抗性机制涉及过氧化氢酶活性增强、海藻糖和糖原积累增加、细胞壁完整性提高以及环境胁迫响应基因的协同上调，基因组突变主要富集于胁迫响应、细胞壁组织和碳水化合物代谢/转运相关基因，为解析氧化胁迫抗性的复杂分子机制提供了新见解。