Metabolic behavior for a mutant Oenococcus oeni strain with high resistance to ethanol to survive under oenological multi-stress conditions
- 作者
- Angela Contreras, Gabriela Diaz, Sebastián N. Mendoza, Mauricio Canto, Eduardo Agosin
- 单位
- 应用微生物实验室，自然资源生物技术中心，农业与林业科学学院，生物技术学院，智利马乌莱天主教大学，塔尔卡，智利；生物技术实验室，化学与生物过程工程系，工程学院，智利天主教大学，圣地亚哥，智利；系统生物学实验室，阿姆斯特丹分子与生命科学研究所（AIMMS），阿姆斯特丹自由大学，阿姆斯特丹，荷兰
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2023）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2023.1100501
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Oenococcus oeni在葡萄酒酿造多胁迫条件（高乙醇、低pH、SO2等）下苹果酸乳酸发酵（MLF）易延迟或停滞，且对其乙醇耐受性相关机制认识不足。
研究策略
采用乙基甲烷磺酸盐（EMS）对O. oeni PSU-1进行随机化学诱变，筛选获得高乙醇抗性突变株E1；在不同葡萄酒（MaxOeno合成酒、赤霞珠、霞多丽）中比较E1与亲本PSU-1的生长、代谢物消耗/生产、转录组差异，并结合基因组规模代谢模型iSM454进行通量平衡分析和NGAM预测。
核心内容
本研究以葡萄酒苹果酸乳酸发酵核心菌种Oenococcus oeni为对象，针对其在高乙醇、低pH及SO2等多重胁迫下发酵易停滞的问题，利用乙基甲烷磺酸盐对PSU-1菌株进行随机化学诱变，筛选获得高乙醇抗性突变株E1。实验在MaxOeno合成酒、赤霞珠和霞多丽三种葡萄酒体系中，比较了突变株与亲本菌株的生长速率、底物消耗及产物生成，并整合转录组测序和基因组规模代谢模型iSM454进行通量平衡分析。结果显示，E1在三种酒中的平均比生长速率较亲本提高39%，其中霞多丽中高达86%；L-苹果酸转化率在赤霞珠中达99.72%，而亲本为64.82%。转录层面，E1中编码UspA样通用应激蛋白的OEOE_1794表达量为亲本的14.4倍，果糖激酶基因OEOE_1708为6.9倍，同时金属离子转运蛋白和PadR家族转录调节因子也显著上调。代谢通量分析揭示E1优先将果糖转化为果糖-6-磷酸而非甘露醇，其生成通量高出86%。这些结果表明随机化学诱变结合多组学分析能有效改良O. oeni的胁迫耐受性，为葡萄酒酿造用工业菌株的定向选育提供了可行策略。
创新点
首次将EMS随机诱变应用于Oenococcus oeni并获得遗传改良菌株；系统整合了转录组、代谢表型和通量分析，鉴定了乙醇耐受相关关键基因（UspA样蛋白、果糖激酶、Mn2+/Fe2+转运蛋白等）。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Oenococcus oeni E1 | 应激响应通路 | OEOE_1794 | UspA样通用应激蛋白 | 调控 | 在突变株中显著过表达，促进细胞在胁迫条件下的生存与生长 |
| Oenococcus oeni E1 | 果糖代谢 | OEOE_1708 | 果糖激酶（EC 2.7.1.4） | 催化 | 将果糖磷酸化为果糖-6-磷酸，增强果糖利用和丙酮酸生成 |
| Oenococcus oeni E1 | 金属离子转运 | OEOE_1795 | Mn2+和Fe2+转运蛋白（NRAMP家族） | 转运 | 提高锰离子摄取，激活苹果酸乳酸酶及相关代谢酶 |
| Oenococcus oeni E1 | 转录调控 | OEOE_0522 | PadR家族转录调节因子 | 调控 | 在转录组中表达上调，可能参与应激应答调控 |
关键发现
- 突变株E1在三种葡萄酒中的比生长速率平均比亲本PSU-1高39%（霞多丽中高86%）
- E1的L-苹果酸转化率在MaxOeno、赤霞珠和霞多丽中分别为19.69%、99.72%和73.25%，而PSU-1分别为13.51%、64.82%和46.16%，平均转化率提高34%（摘要数据）或64%（结果讨论数据）
- E1在赤霞珠中生物量比PSU-1高67%，霞多丽中高18%，MaxOeno中高61%
- E1的果糖-6-磷酸生成通量比甘露醇生成速率高86%
- E1中OEOE_1794（UspA样蛋白）相对表达量为PSU-1的14.4倍，OEOE_1708（果糖激酶）为6.9倍
- 在MaxOeno中E1的NGAM为5.48 mmol gDCW⁻¹ h⁻¹，PSU-1为9.54
- 在赤霞珠中分别为0.64和0.30，霞多丽中分别为0.74和1.36。
研究结论
随机化学诱变可有效改良Oenococcus oeni，获得的乙醇抗性突变株E1通过增强果糖和葡萄糖代谢、提高L-苹果酸向L-乳酸转化效率、上调UspA样应激蛋白和Mn2+/Fe2+转运蛋白表达，在多种葡萄酒胁迫条件下表现出优于亲本菌株的生长能力和苹果酸乳酸发酵性能。