Recruitment of a Foreign Quinone into the A1 Site of Photosystem I: I. Genetic and Physiological Characterization of Phylloquinone Biosynthetic Pathway Mutants in Synechocystis sp. PCC 6803
- 作者
- T. Wade Johnson, Gaozhong Shen, Boris Zybaivol, Derrick Kolling, Ricardo Reategui, Steve Beauparlant, Ilya R. Vassiliev, Donald A. Bryant, A. Daniel Jones, John H. Golbeck, Parag R. Chitnis
- 单位
- Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, Ames, Iowa 50011; Departments of Biochemistry and Molecular Biology and Chemistry, Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania 16802
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（2000）
- DOI
- 10.1074/jbc.275.12.8523
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明叶绿醌（phylloquinone）在光系统I电子传递中的作用；通过敲除其生物合成基因，研究A1位点缺失叶绿醌后对PS I功能的影响。
研究策略
基于大肠杆菌甲萘醌生物合成途径，在集胞藻PCC 6803基因组中鉴定menA和menB同源基因，通过同源重组定向敲除这两个基因，构建突变株，并进行生理、生化和光谱学表征。
核心内容
本研究通过同源重组定向敲除集胞藻PCC 6803基因组中鉴定的menA和menB同源基因，构建了叶绿醌生物合成缺陷突变体，以阐明叶绿醌在光系统I电子传递中的功能。突变体在低光（20 μE m⁻² s⁻¹）下可光自养生长，倍增时间约为野生型的2倍，但在高光下无法生长；添加葡萄糖或除草剂atrazine后，光异养生长的倍增时间接近野生型。生化分析表明，突变体PS I中检测不到叶绿醌（<0.02/ P700），但质体醌-9含量与野生型PS I中的叶绿醌相当。整链氧释放速率为野生型的57-62%，而PS II介导的氧释放速率不受影响；PS I复合物从cytochrome c6到flavodoxin的最大电子传递速率达野生型的82-84%。低温EPR证实铁硫簇F_A和F_B仍可正常光还原。这些结果首次证明蓝藻menA和menB参与叶绿醌合成，并揭示缺乏叶绿醌时PS I能招募质体醌-9至A1位点且高效支持电子传递，表明叶绿醌并非PS I电子传递的必需辅因子。
创新点
首次确认蓝藻中menA和menB基因参与叶绿醌生物合成；发现缺乏叶绿醌时，光系统I将质体醌-9招募到A1位点，且该醌能高效支持电子传递；表明叶绿醌并非光系统I电子传递所必需的辅因子。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | phylloquinone生物合成途径 | menA | MenA (phytyl transferase) | 催化 | 催化1,4-二羟基-2-萘甲酸与植基链的连接；敲除导致叶绿醌缺失 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | phylloquinone生物合成途径 | menB | MenB (1,4-dihydroxy-2-naphthoate synthase) | 催化 | 催化形成萘环结构；敲除导致叶绿醌缺失 |
关键发现
- menA和menB突变体在低光（20 μE m^-2 s^-1）下可光自养生长，倍增时间分别为73±3.4 h和71±2.8 h，约为野生型（34±1.2 h）的2倍
- 在高光（120 μE m^-2 s^-1）下无法生长。光混养（加5 mM葡萄糖）低光下倍增时间为22±1.8 h和24±2.3 h（野生型17±1.1 h），高光下无法生长
- 加入20 μM atrazine后光异养生长恢复，低光下倍增时间为25±2.1 h和26±1.8 h（野生型22±1.6 h），高光下为29±2.6 h和31±3.2 h（野生型24±2.2 h）。整链氧释放速率为787±49和718±57 μmol O2/A730/h，分别为野生型（1260±76）的62%和57%
- PS II介导的氧释放速率与野生型相近（约1400 μmol O2/A730/h）。叶绿素含量为3.36±0.23和3.43±0.32 μg Chl/A730/ml（野生型4.21±0.18）。每细胞光氧化性P700含量为野生型的50-60%。HPLC和GC/MS显示突变体PS I中无可检测的phylloquinone（<0.02 phylloquinone/P700），但含有plastoquinone-9，其含量与野生型PS I中的phylloquinone相当。PS I复合物从cytochrome c6到flavodoxin的最大电子传递速率分别为7128和6948 μmol mg Chl^-1 h^-1，野生型为8460，即82-84%效率
- 换算为每个PS I每秒电子数：menA为198，menB为193，野生型为235。低温EPR显示F_A和F_B均可光还原，表明铁硫簇接受电子的能力未受损。
研究结论
在缺乏叶绿醌的情况下，Synechocystis sp. PCC 6803的光系统I能够在A1位点结合质体醌-9，并维持82-84%的野生型电子传递效率，说明叶绿醌不是PS I电子传递的必需辅因子；menA和menB是叶绿醌生物合成所必需的基因。