Adaptive laboratory evolution to obtain furfural tolerant Saccharomyces cerevisiae for bioethanol production and the underlying mechanism
- 作者
- Lan Yao, Youpiao Jia, Qingyan Zhang, Xueyun Zheng, Haitao Yang, Jun Dai, Xiong Chen
- 单位
- Key Laboratory of Fermentation Engineering (Ministry of Education), Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation (Ministry of Education and Hubei Province), College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan, China; Hubei Provincial Key Laboratory of Green Materials for Light Industry, Hubei University of Technology, Wuhan, China
- 杂志
- Frontiers in Microbiology（2024）
- DOI
- 10.3389/fmicb.2023.1333777
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素预处理过程中产生的糠醛会抑制酿酒酵母的生长和乙醇发酵，需要获得糠醛耐受菌株并阐明其分子机制，以提升纤维素乙醇的生产效率。
研究策略
采用适应性实验室进化（ALE）在逐步升高糠醛浓度的条件下长期传代筛选耐受菌株，结合全基因组重测序鉴定关键突变基因，再利用CRISPR/Cas9技术构建点突变菌株进行反向验证，并通过生理生化测定和qRT-PCR解析耐受机制。
核心内容
该研究通过适应性实验室进化（ALE）在逐步升高糠醛浓度的条件下长期传代筛选，获得糠醛耐受型酿酒酵母菌株12-1，并结合全基因组重测序与CRISPR/Cas9反向工程解析其分子机制。结果显示，12-1菌株在4 g/L糠醛胁迫下延滞期缩短36小时，乙醇转化率提高6.67%，特定生长率提升32.43%，乙醇产量增加7.02%，且糠醛在48小时内完全降解。全基因组测序鉴定出1219个突变，其中ADR1基因第1802位点A→G突变被证实为关键遗传基础。基于该突变构建的ADR1_1802点突变株在4 g/L糠醛下延滞期缩短20小时，胞内甘油含量降低87.74%，SOD和CAT酶活性分别增加84.52%和24.72%；qRT-PCR显示醛还原酶基因GRE2和ADH6转录水平分别上调53.69%和44.95%。该突变通过加速糠醛还原为糠醇、调节甘油代谢及增强抗氧化防御，协同缩短延滞期并提升乙醇发酵性能，为工业菌株的定向改造提供了新的遗传靶点。
创新点
将ALE与全基因组测序及CRISPR/Cas9反向工程相结合，发现并证实ADR1基因第1802位点突变（A→G）可显著增强酿酒酵母的糠醛耐受性；揭示了突变通过加速糠醛向糠醇的还原、降低胞内甘油消耗以及提高SOD和CAT酶活性来缩短延滞期、提高乙醇转化率。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (ADR1_1802 mutant) | 糠醛耐受与甘油代谢调控 | ADR1 | Adr1p | 调控 | 转录因子；点突变位于基因第1802位（A→G），导致第601位赖氨酸变为精氨酸；突变使4 g/L糠醛下延滞期缩短20 h |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (ADR1_1802 mutant) | 糠醛还原降解 | GRE2 | 甲基乙二醛还原酶/醛还原酶 | 催化 | 4 g/L糠醛处理下转录水平较对照升高53.69%，被确定为糠醛还原的关键基因 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (ADR1_1802 mutant) | 糠醛还原降解 | ADH6 | NAD(P)H依赖性醛还原酶 | 催化 | 转录水平较对照升高44.95%，参与糠醛向糠醇的还原 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (ADR1_1802 mutant) | 糠醛还原降解 | GRE3 | 醛糖还原酶 | 催化 | 糠醛胁迫下转录水平较无糠醛对照上调3.83倍 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (ADR1_1802 mutant) | 糠醛还原降解 | YPR1 | 醛还原酶 | 催化 | 糠醛胁迫下转录水平较无糠醛对照上调3.15倍 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (ADR1_1802 mutant) | 糠醛还原降解 | ARI1 | 醛还原酶 | 催化 | 糠醛胁迫下转录水平较无糠醛对照上调2.84倍 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (ADR1_1802 mutant) | 乙醛代谢 | ALD4 | 乙醛脱氢酶 | 催化 | 糠醛胁迫下转录水平较无糠醛对照上调1.71倍 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (ADR1_1802 mutant) | 抗氧化防御 | — | 超氧化物歧化酶(SOD) | 催化 | 延滞期酶活性较对照菌株增加84.52% |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D (ADR1_1802 mutant) | 抗氧化防御 | — | 过氧化氢酶(CAT) | 催化 | 延滞期酶活性较对照菌株增加24.72% |
关键发现
- 通过ALE获得糠醛耐受菌株12-1，在4 g/L糠醛下延滞期缩短36 h，乙醇转化率提高6.67%，特定生长率提高32.43%，乙醇产量增加7.02%，且糠醛在48 h内完全降解
- 4 g/L糠醛使乙醇生产力降低82%。全基因组测序共发现1219个突变（403个Indel、816个SNP），错义突变基因包括UTH1、RET1、HDA1、HYP2、ADR1、TFC1、COS8，移码突变基因包括PAU20和CDC14。基于ADR1突变构建的ADR1_1802突变株在4 g/L糠醛下延滞期缩短20 h，胞内甘油含量降低87.74%，SOD酶活性增加84.52%，CAT酶活性增加24.72%
- qRT-PCR显示GRE2转录水平升高53.69%，ADH6转录水平升高44.95%。
研究结论
适应性实验室进化可有效获得糠醛耐受性增强的酿酒酵母菌株，全基因组测序揭示ADR1基因突变是提高糠醛耐受性的关键遗传基础。ADR1_1802突变通过上调GRE2和ADH6等醛还原酶的表达加速糠醛还原为糠醇，同时调节甘油代谢和增强抗氧化酶活性，从而缩短延滞期并提高乙醇发酵性能，为工业菌株的基因工程改造提供了新靶点。