Enhanced sialylation of recombinant human erythropoietin in Chinese hamster ovary cells by combinatorial engineering of selected genes
- 作者
- Young-Dok Son, Yeon Tae Jeong, Seung-Yeol Park, Jung Hoe Kim
- 单位
- Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology
- 杂志
- Glycobiology（2011）
- DOI
- 10.1093/glycob/cwr034
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
治疗性糖蛋白末端半乳糖暴露会被肝脏去唾液酸糖蛋白受体快速清除，需要通过增强N-聚糖末端唾液酸化来提高其体内半衰期。
研究策略
利用sialuria患者来源的GNE/MNK突变体解除CMP-唾液酸的反馈抑制，同时过表达CMP-唾液酸转运蛋白（CMP-SAT）和α2,3-唾液酸转移酶（α2,3-ST），组合增强CHO细胞中rhEPO的唾液酸化通路。
核心内容
该研究针对治疗性糖蛋白末端唾液酸化不足导致体内半衰期缩短的问题，在CHO细胞中通过组合工程策略增强重组人促红细胞生成素（rhEPO）的唾液酸化。研究者首先筛选出源自sialuria患者的GNE/MNK双突变体R263L-R266Q，该突变体在150 μM CMP-唾液酸存在下仍保持93.6%的相对活性，解除了产物对唾液酸生物合成的反馈抑制。随后将该突变体与CMP-唾液酸转运蛋白及α2,3-唾液酸转移酶三基因共表达于CHO细胞，所得细胞株胞内CMP-唾液酸浓度较对照提高约10.5至10.7倍，rhEPO唾液酸含量从对照水平分别增加约30%和43%，达到8.8和9.6 mol唾液酸/mol rhEPO。四唾液酸化N-聚糖比例增加约32%，而脱唾液酸和单唾液酸化比例下降约50%，等电聚焦分析显示酸性异构体比例由46.0%升至72.7%。结果表明，解除反馈抑制与增强活化和转移步骤的组合策略可有效提高治疗性糖蛋白的唾液酸化程度，为生产高唾液酸化生物药物提供了可行方案。
创新点
筛选出双突变GNE/MNK（R263L-R266Q），其相对活性达93.6%且不受CMP-唾液酸反馈抑制；将该突变体与CMP-SAT、α2,3-ST三基因共表达于CHO细胞，显著提高rhEPO唾液酸化水平。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（EC2-1H9） | 唾液酸生物合成途径 | GNE/MNK（大鼠，突变体R263L-R266Q） | UDP-GlcNAc 2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶（GNE/MNK） | 催化 | 解除CMP-唾液酸反馈抑制，提高胞内CMP-唾液酸合成 |
| 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（EC2-1H9） | 唾液酸活化和转运途径 | CMP-SAT（中国仓鼠） | CMP-唾液酸转运蛋白 | 转运 | 将CMP-唾液酸从细胞质转运至高尔基体 |
| 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（EC2-1H9） | N-聚糖唾液酸化途径 | α2,3-ST（人） | α2,3-唾液酸转移酶 | 催化 | 将唾液酸转移到N-聚糖末端半乳糖残基 |
关键发现
- R263L-R266Q突变体在150 μM CMP-唾液酸存在下仍保持活性，相对活性为93.6%（野生型为100%）
- 表达该突变体的细胞株（EC2-1H9-CTSTrEKm 2和9）胞内CMP-唾液酸浓度较对照提高10.5和10.7倍
- rhEPO唾液酸含量分别增加约30%和43%（达8.8和9.6 mol唾液酸/mol rhEPO）
- 四唾液酸化N-聚糖比例增加约32%，而脱唾液酸和单唾液酸化比例下降约50%
- IEF分析显示pI<4.5的酸性异构体比例从对照的46.0%升至72.7%（EC2-1H9-CTSTrEKm 9）。
研究结论
通过共表达sialuria突变型大鼠GNE/MNK（R263L-R266Q）、中国仓鼠CMP-SAT和人α2,3-ST，可有效提高CHO细胞胞内CMP-唾液酸水平并增强rhEPO的唾液酸化，为生产高唾液酸化治疗性糖蛋白提供了新策略。