Characterization of a Fungal L-fucokinase involved in Mortierella alpina GDP-L-fucose Salvage Pathway
- 作者
- Hongchao Wang, Chen Zhang, Haiqin Chen, Qin Yang, Xin Zhou, Zhennan Gu, Hao Zhang, Wei Chen, Yong Q. Chen
- 单位
- 江南大学食品科学与技术学院，食品科学与技术国家重点实验室；食品安全与营养协同创新中心；维克森林医学院癌症生物学系
- 杂志
- Glycobiology（2017）
- DOI
- 10.1093/glycob/cww032
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
真菌中GDP-L-岩藻糖补救途径的L-岩藻糖激酶（FUK）尚未被鉴定和功能表征，本研究旨在阐明M. alpina中FUK在GDP-L-岩藻糖合成中的作用及其酶学特性。
研究策略
从M. alpina基因组中挖掘FUK基因，异源表达于大肠杆菌并纯化重组蛋白；通过LC-MS鉴定反应产物；系统测定温度、pH、金属离子和产物对酶活的影响；利用qRT-PCR分析FUK在脂质积累过程中的转录水平；并进行序列比对和系统发育分析。
核心内容
该研究首次在分子水平上表征了高山被孢霉中的L-岩藻糖激酶（FUK），证实该真菌存在类似高等动物的GDP-L-岩藻糖补救途径。研究者从基因组中挖掘FUK基因，在大肠杆菌中异源表达并纯化出约49 kDa的重组蛋白，通过LC-MS确认其催化产物。酶学表征显示，该酶最适温度为37°C、最适pH为8.0，2 mM Mg²⁺激活能力最强，而Ca²⁺、Cu²⁺、K⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺均无激活作用；200 μM GDP-L-岩藻糖存在时仍保留70%以上活性，表明其受产物反馈抑制较弱。动力学参数为Km(L-岩藻糖)=1.59 mM，Kcat=23.35 s⁻¹。qRT-PCR分析发现，氮完全耗尽时FUK基因表达上调4.3倍，GDP-L-岩藻糖含量在脂质积累期（69 h）达0.096 mg/g细胞，高于增殖期的0.074 mg/g细胞，产量超过0.4 mg/L。研究表明FUK是高山被孢霉GDP-L-岩藻糖补救途径的关键酶，在氮胁迫下上调表达以支持脂质积累阶段的岩藻糖基化需求，该真菌有望成为GDP-L-岩藻糖生产的替代微生物来源。
创新点
首次在真菌中分子水平表征了L-岩藻糖激酶（FUK）；证明M. alpina存在类似高等动物的GDP-L-岩藻糖补救途径；发现FUK在氮耗尽启动脂质积累时显著上调表达；提出M. alpina可作为GDP-L-岩藻糖生产的替代来源。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Mortierella alpina (ATCC 32222) | GDP-L-岩藻糖补救途径 | FUK | L-岩藻糖激酶 | 催化 | 首次在真菌中表征，催化L-岩藻糖生成L-岩藻糖-1-磷酸；氮耗尽时转录上调4.3倍 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | GDP-L-岩藻糖补救途径 | FUK | 重组His标签L-岩藻糖激酶 | 催化 | 用于异源表达和纯化，分子量约49 kDa，产量12.15 μg/mL |
| Mortierella alpina (ATCC 32222) | GDP-L-岩藻糖从头合成途径 | GMD | GDP-D-甘露糖4,6-脱水酶 | 催化 | 从头合成途径基因，qRT-PCR显示表达变化小于1倍 |
| Mortierella alpina (ATCC 32222) | GDP-L-岩藻糖从头合成途径 | GMER | GDP-酮基-6-脱氧甘露糖3,5-表异构酶/4-还原酶 | 催化 | 从头合成途径基因，qRT-PCR显示表达变化小于1倍 |
| Mortierella alpina (ATCC 32222) | 岩藻糖基化途径 | FUT10, FUT11, OFUT | 岩藻糖基转移酶10、岩藻糖基转移酶11、O-岩藻糖基转移酶 | 催化 | 基因组中发现的潜在GDP-L-岩藻糖依赖性基因，功能有待实验验证 |
关键发现
- GDP-L-岩藻糖含量在脂质积累期（69 h）为0.096 mg/g细胞，高于细胞增殖期（18.5 h）的0.074 mg/g细胞，产量大于0.4 mg/L
- FUK基因在氮完全耗尽（22 h）时表达上调4.3倍
- 重组FUK分子量约49 kDa，表达产量12.15 μg/mL
- 最适温度37°C，最适pH 8.0
- Mg2+在2 mM时激活能力最强，Mn2+相似，Co2+和Fe2+活性低于5%，Ca2+、Cu2+、K+、Hg2+、Ni2+、Zn2+无活性
- 200 μM GDP-L-岩藻糖存在时保留70%以上活性
- Km(L-岩藻糖)=1.59 mM，Vmax=0.035 mM min^-1，Kcat=23.35 s^-1。
研究结论
M. alpina的FUK是GDP-L-岩藻糖补救途径的关键酶，类似高等动物而非植物/细菌的双功能酶；FUK在氮胁迫下上调，提示其在脂质积累阶段对GDP-L-岩藻糖合成具有重要作用；M. alpina可作为GDP-L-岩藻糖生产的替代微生物来源。