高级醇 · 代谢工程文献库

← 返回列表

Disruption of the Structural Gene for Farnesyl Diphosphate Synthase in Escherichia coli

作者
Shingo Fujisaki, Isao Takahashi, Hiroshi Hara, Kensuke Horiuchi, Tokuzo Nishino, Yukinobu Nishimura
单位
Department of Biomolecular Science, Faculty of Science, Toho University; National Institute of Genetics; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science, Saitama University; Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, Tohoku University
杂志
Journal of Biochemistry（2005）
DOI
10.1093/jb/mvi049
所属领域
代谢工程
关键词
farnesyl diphosphateisoprenoidmenaquinoneubiquinoneundecaprenyl phosphate
阅读原文
查看 PDF 原文

解决的核心问题

确定大肠杆菌中法尼基焦磷酸合酶结构基因ispA是否为必需基因，并阐明其缺失对类异戊二烯生物合成的影响。

研究策略

通过插入neo基因破坏染色体ispA基因，构建ispA缺失突变株，测定其生长特性、异戊二烯类化合物含量及相关酶活性。

研究路线图

100%
研究问题：ispA是否为必需基因？
策略：neo插入破坏ispA基因构建零突变株
关键改造：neo基因插入破坏染色体ispA
构建多株零突变株（SF6/SF7等）
表型分析：有氧/厌氧生长对比
关键结果：有氧产量为WT的70-80%，厌氧相近
代谢物分析：UQ-8/MK-8/多萜醇水平变化
酶活性与补偿机制探索（IspB/UppS）
结论：ispA非必需，IPP浓度调节代谢流向
Text is not SVG - cannot display

下载 .drawio 源文件

核心内容

该研究通过插入neo基因破坏大肠杆菌染色体上的ispA基因，构建了ispA零突变株SF6和SF7，首次证明编码法尼基焦磷酸合酶的ispA并非必需基因。在有氧条件下，突变株的生长产量仅为野生型的70%–80%，厌氧条件下则与野生型几乎一致；倍增时间从野生型的75±3分钟延长至SF6的137±20分钟和SF7的106±13分钟。代谢物分析显示，突变株中泛醌-8水平降至野生型的5%和13%，甲萘醌-8降至13%和18%，但多萜醇磷酸水平仍保持40%和69%；IPP与二甲基烯丙基焦磷酸的缩合活性仅为野生型的5%。残余活性可能由八异戊二烯焦磷酸合酶或十一异戊二烯焦磷酸合酶部分补偿。该结果揭示大肠杆菌类异戊二烯代谢途径具有内在冗余性，且IPP水平对代谢流向分配起关键调控作用，为理解该通路的结构弹性及异源表达FPP衍生物提供了重要依据。

创新点

首次证明大肠杆菌ispA基因非必需；发现其他异戊二烯转移酶（如八异戊二烯焦磷酸合酶或十一异戊二烯焦磷酸合酶）可能部分补偿FPP合酶功能，并推测IPP水平对代谢流向具有重要调控作用。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli 类异戊二烯生物合成途径（MEP途径） ispA Farnesyl diphosphate synthase (FPP synthase) 催化 催化IPP与二甲基烯丙基焦磷酸（C5）和牻牛儿基焦磷酸（C10）连续缩合生成法尼基焦磷酸（C15）；被neo基因插入破坏后构建零突变株。
Escherichia coli 类异戊二烯生物合成途径 ispB Octaprenyl diphosphate synthase 催化 催化IPP与FPP缩合生成全E-八异戊二烯焦磷酸（C40），是泛醌-8和甲萘醌-8的前体，可能部分补偿FPP合酶活性。
Escherichia coli 类异戊二烯生物合成途径 rth Undecaprenyl diphosphate synthase 催化 催化FPP与IPP缩合生成Z,E-混合多异戊二烯焦磷酸（C50-C60），是糖载体脂质的前体，可能部分补偿FPP合酶活性。
Escherichia coli MEP途径（甲基赤藓醇磷酸途径） dxs 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 催化 异戊二烯生物合成途径的第一个酶，位于ispA下游，其表达可能受到ispA插入neo基因的极性效应影响。

关键发现

  1. ispA零突变株在有氧条件下生长产量为野生型的70%-80%，厌氧条件下与野生型几乎相同
  2. 突变株中泛醌-8水平仅为野生型的5%（SF6）和13%（SF7），甲萘醌-8水平为野生型的13%和18%
  3. 多萜醇磷酸（总多异戊二烯磷酸）水平为野生型的40%（SF6）和69%（SF7）
  4. 突变株中IPP与二甲基烯丙基焦磷酸缩合活性仅为野生型的5%
  5. SF6和SF7的倍增时间分别为137±20 min和106±13 min，野生型为75±3 min。

研究结论

大肠杆菌ispA基因并非必需，其缺失导致泛醌-8和甲萘醌-8合成显著减少，但细胞仍能存活；残余的FPP合成活性可能由八异戊二烯焦磷酸合酶或十一异戊二烯焦磷酸合酶提供；Z,E-混合多萜醇磷酸水平仅中度下降，表明IPP浓度对异戊二烯代谢流向具有重要调节作用。