Functional Analysis of Eubacterial ent-Copaly1Diphosphate Synthase and Pimara-9(11),15-Diene Synthase with Unique Primary Sequences
- 作者
- Chiho Ikeda, Yutaka Hayashi, Nobuya Itoh, Haruo Seto, Tohru Dairi
- 单位
- Biotechnology Research Center, Toyama Prefectural University, Toyama 939-0398, Japan; Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture, Setagaya-ku, 156-8502, Japan
- 杂志
- Journal of Biochemistry（2007）
- DOI
- 10.1093/jb/mvm004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
原核生物的二萜环化酶与真核酶在初级序列上差异显著，ORF3功能未知且与任何已知蛋白均无同源性，需阐明其催化功能；同时缺乏对原核ent-CDP合酶和PMD合酶酶学性质的系统表征。
研究策略
从Streptomyces sp. KO-3988中克隆ORF2和ORF3，在E. coli中异源表达并纯化重组酶；通过体外酶促反应、HPLC、NMR和质谱鉴定产物结构；利用凝胶过滤、金属离子置换、pH/温度优化和动力学测定等系统表征两种酶的酶学性质。
核心内容
该研究从Streptomyces sp. KO-3988中克隆了参与viguiepinol生物合成的两个未知功能的基因ORF2和ORF3，并在大肠杆菌中异源表达、纯化了相应重组酶。体外酶促反应结合HPLC、NMR和质谱分析表明，ORF2编码ent-CDP合酶，催化GGDP环化生成ent-CDP；ORF3则编码一种新型PMD合酶，催化ent-CDP转化为pimara-9(11),15-diene。酶学表征显示，ent-CDP合酶为同源二聚体，绝对依赖Mg²⁺，最适pH 5.5、温度35°C，对GGDP的Km为13.7 μM，kcat为3.3×10⁻² s⁻¹；PMD合酶为单体，仅含295个氨基酸，绝对依赖Mg²⁺，最适pH 7.0、温度30°C，对ent-CDP的Km为2.6 μM，kcat为1.4×10⁻³ s⁻¹。序列比对表明原核ent-CDP合酶与真核酶同源性仅约27%，而PMD合酶与已知蛋白无同源性。这是首次从原核生物中鉴定出这两类酶，证实原核二萜环化酶具有独特的初级序列，可能独立于真核酶进化，为理解二萜环化酶的催化机制和进化关系提供了新视角。
创新点
首次从原核生物中鉴定了ent-CDP合酶（ORF2）和PMD合酶（ORF3）；发现ORF3尽管与任何已知蛋白无序列同源性，却催化ent-CDP转化为PMD；证实原核二萜环化酶具有独特初级序列，且与真核酶可能独立进化。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces sp. KO-3988 | viguiepinol（3-羟基海松-9(11),15-二烯）生物合成 | ORF2 | ent-CDP合酶（ent-copalyl diphosphate synthase） | 催化 | 催化GGDP环化生成ent-CDP，Type-B二萜环化酶；在E. coli中异源表达并以His标签纯化。 |
| Streptomyces sp. KO-3988 | viguiepinol（3-羟基海松-9(11),15-二烯）生物合成 | ORF3 | PMD合酶（pimara-9(11),15-diene synthase） | 催化 | 催化ent-CDP生成PMD，Type-A二萜环化酶；仅295个氨基酸，与已知蛋白无同源性；以MBP融合形式在E. coli中表达。 |
关键发现
- ORF3被证实为PMD合酶，催化ent-CDP转化为PMD。ent-CDP合酶（ORF2）为同源二聚体，绝对依赖Mg2+（最适1 mM），相对活性Zn2+ 82%、Co2+ 69%、Mn2+ 63%、Ni2+ 32%，最适pH
- 5、温度35°C，对GGDP的Km为13.7±1.0 μM，kcat为3.3×10^-2 s^-1。PMD合酶（ORF3）为单体，绝对依赖Mg2+（最适1 mM），Co2+相对活性100%、Zn2+ 59%、Ni2+ 57%，最适pH
- 0、温度30°C，对ent-CDP的Km为2.6±0.2 μM，kcat为1.4×10^-3 s^-1。PMD合酶仅295个氨基酸，与Cyc2有15%同源性；ent-CDP合酶与TDP合酶有36%同源性，与真核ent-CDP合酶约27%同源性。
研究结论
本研究首次鉴定了原核生物的ent-CDP合酶和PMD合酶，证实原核二萜环化酶具有独特的初级序列，与真核酶可能独立进化。ORF3可作为PMD合酶的典型代表，为后续结构解析和机制研究提供基础。