Overexpression of Artemisia annua Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase Increases Lignin and Coumarin and Reduces Artemisinin and Other Sesquiterpenes
- 作者
- Dongming Ma, Chong Xu, Fatima Alejos-Gonzalez, Hong Wang, Jinfen Yang, Rika Judd, De-Yu Xie
- 单位
- Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, China; Department of Plant & Microbial Biology, North Carolina State University, Raleigh, NC, United States; Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, China
- 杂志
- Frontiers in Plant Science（2018）
- DOI
- 10.3389/fpls.2018.00828
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明青蒿肉桂醇脱氢酶（AaCAD）在木质素/香豆素与青蒿素等倍半萜生物合成途径中的双重作用，揭示两条细胞质途径间的代谢交叉调控机制，为青蒿素高产工程提供依据。
研究策略
从自交纯合青蒿中克隆AaCAD基因，通过异源表达和酶学分析表征其催化特性；构建2×35S启动子驱动的过表达载体，经农杆菌介导转化获得青蒿转基因株系；综合运用共聚焦显微定位、AcBr木质素定量、GC-MS代谢谱和HPLC-MS技术，比较转基因与野生型在木质素、香豆素、青蒿素及倍半萜含量上的差异。
核心内容
该研究从自交纯合青蒿中克隆了肉桂醇脱氢酶基因AaCAD，并通过异源表达与酶学分析确认其催化特性。在青蒿中利用2×35S启动子驱动AaCAD过表达，结合共聚焦定位、木质素定量及GC-MS、HPLC-MS代谢谱分析，系统比较了转基因株系与野生型的代谢差异。结果显示，重组AaCAD对芥子醛的Km最低，催化效率最高；过表达后木质素和香豆素含量显著上升，而青蒿素含量较野生型显著下降（P<0.01），arteannin B及其他六种倍半萜也同步降低，GFP融合证实该酶定位于细胞质。研究表明，AaCAD在细胞质中发挥双重调控作用：一方面促进苯丙烷途径流向木质素与香豆素，另一方面通过消耗青蒿醛等中间产物抑制青蒿素合成，揭示了苯丙烷与倍半萜途径间由该酶介导的代谢交叉。该发现为理解青蒿素生物合成调控机制提供了关键证据，对优化高产青蒿素的代谢工程策略具有直接参考价值。
创新点
首次在自交纯合青蒿中过表达AaCAD并进行系统代谢分析；发现AaCAD同时正向调控木质素/香豆素合成并负向调控青蒿素等倍半萜合成，揭示其介导的苯丙烷与倍半萜途径之间的代谢crosstalk；通过GFP融合证实AaCAD定位于细胞质。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 | 异源蛋白质表达 | AaCAD | 6xHis标记的重组AaCAD | 催化 | 用于测定三种木质素底物的动力学参数 |
| Nicotiana benthamiana | 瞬时表达系统 | AaCAD-EGFP | AaCAD-EGFP融合蛋白 | 区室化 | 共聚焦显微镜显示定位于细胞质 |
| Artemisia annua (SP品系) | 木质素/苯丙烷生物合成 | AaCAD | AaCAD（肉桂醇脱氢酶） | 催化 | 过表达显著增加木质素和香豆素含量 |
| Artemisia annua (SP品系) | 青蒿素/倍半萜生物合成 | AaCAD | AaCAD | 催化 | 过表达显著降低青蒿素、arteannin B和6种其他倍半萜含量 |
关键发现
- 克隆的AaCAD开放阅读框长1086 bp，编码362个氨基酸，与先前报道序列仅3个氨基酸不同。重组AaCAD可催化对-香豆醛、松柏醛和芥子醛转化为相应醇，动力学分析显示其对芥子醛的Km最低（催化偏好），Vmax三种底物相近，Kcat/Km以芥子醛最高。在SP青蒿中过表达AaCAD后，AcBr法测定的木质素含量显著高于野生型
- GC-MS显示香豆素含量显著增加
- HPLC-MS显示青蒿素含量显著低于野生型（P<0.01）
- 同时arteannin B和6种其他倍半萜类含量均显著降低。GFP融合定位显示AaCAD定位于细胞质。
研究结论
AaCAD在细胞质中发挥双重功能：一方面促进木质素和香豆素合成，另一方面负调控青蒿素等倍半萜合成。过表达AaCAD通过消耗青蒿醛导致青蒿素产量下降，揭示了苯丙烷与青蒿素途径间由AaCAD介导的代谢交叉。该研究对理解青蒿素生物合成调控和指导青蒿素高产代谢工程具有重要价值。