Genomic Analysis of Terpene Synthase Family and Functional Characterization of Seven Sesquiterpene Synthases from Citrus sinensis
- 作者
- Berta Alquézar, Ana Rodriguez, Marcos de la Peña, Leandro Peña
- 单位
- Laboratorio de Biotecnologia Vegetal, Pesquisa y Desenvolvimento, Fundo de Defesa da Citricultura, Araraquara, Brazil; Instituto de Biologia Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas and Universidad Politécnica de Valencia, Valencia, Spain
- 杂志
- Frontiers in Plant Science（2017）
- DOI
- 10.3389/fpls.2017.01481
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
柑橘萜烯类挥发物对果实香气和植物防御至关重要，但其生物合成的生理、生化和遗传调控仍不清楚。本研究旨在利用甜橙基因组序列全面鉴定萜烯合酶（TPS）家族，并重点功能表征其中的倍半萜合酶。
研究策略
通过BLASTp搜索甜橙基因组数据库（CAP），鉴定出95个TPS位点；利用基因结构、保守基序和系统发育分析进行分类；克隆七个候选倍半萜合酶cDNA，在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，以FPP为底物进行体外酶活测定，通过GC-MS分析产物；结合分子建模解释产物特异性。
核心内容
本研究对甜橙基因组中的萜烯合酶（TPS）基因家族进行了全基因组鉴定与功能表征。通过BLASTp搜索共鉴定出95个TPS位点，其中55个编码推测具有催化功能的全长TPS，涵盖TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-e/f和TPS-g全部被子植物亚家族。在此基础上，克隆了七个候选倍半萜合酶cDNA并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，以法尼基焦磷酸（FPP）为底物进行体外酶活测定，通过GC-MS分析产物。结果显示这些酶具有高度产物多样性：CsSesquiTPS1主要产生62.38%的(Z)-β-cubebene/α-copaene混合物；CsSesquiTPS3产生74.74%的β-farnesene；CsSesquiTPS4主要产生β-elemene并伴有多种倍半萜；CsSesquiTPS6a仅产生β-caryophyllene，而CsSesquiTPS6b还额外产生23.14%的α-humulene；CsSesquiTPS6c因D319G突变完全失活。这些结果揭示了甜橙倍半萜合酶在氨基酸水平上的微小差异即可显著改变产物谱，表明该基因家族的高度分化是柑橘倍半萜多样性的重要来源，为理解柑橘香气形成及植物防御的分子机制提供了基础。
创新点
首次对柑橘类植物（甜橙）的TPS基因家族进行全基因组鉴定，发现95个位点并系统分类；首次功能表征了七个甜橙倍半萜合酶，包括新的多功能酶，并揭示了氨基酸差异（如CsSesquiTPS6c的D319G失活）对产物特异性的影响。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | Cs5g23510 | CsSesquiTPS1 | 催化 | 重组蛋白以FPP为底物，产生(Z)-β-cubebene和α-copaene混合物（62.38%）。 |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | Cs4g12120 | CsSesquiTPS2 | 催化 | 主要产物为β-cadinene（59.19±4.63%）和α-copaene（25.84±2.76%），另有α-cubebene和γ-cadinene。 |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | orange1.1t03302 | CsSesquiTPS3 | 催化 | 主要产物为β-farnesene（74.74±1.94%），另有β-sesquiphellandrene、zingiberene和β-maaliene。 |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | Cs4g12350 | CsSesquiTPS4 | 催化 | 主要产物为β-elemene（>50%），并产生β-caryophyllene（6.22±0.50%）、α-humulene（12.68±0.60%）和α-/β-/γ-selinene。 |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | Cs4g12400 | CsSesquiTPS5a/CsSesquiTPS5b | 催化 | 两个克隆均产生alloaromadendrene、ledene和β-cadinene为主要产物（各约20-31%），另有微量α-cubebene、α-copaene等。 |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | orange1.1t004360 | CsSesquiTPS6a/CsSesquiTPS6b/CsSesquiTPS6c | 催化 | 6a仅产生β-caryophyllene；6b产生β-caryophyllene（73.51±0.26%）和α-humulene（23.14±0.30%）；6c因D319G突变无活性。 |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | Cs4g11980 | CsSesquiTPS7 | 催化 | 产生β-caryophyllene和α-humulene，比例相近（合计约75.25%）。 |
关键发现
- 甜橙基因组共鉴定出95个TPS位点，其中55个编码推测的功能性TPS，包含TPS-a（28个）、TPS-b（18个）、TPS-c（2个）、TPS-e/f（2个）和TPS-g（5个）所有被子植物亚家族
- 功能表征结果显示：CsSesquiTPS1产生62.38%的(Z)-β-cubebene/α-copaene混合物
- CsSesquiTPS2主要产物为β-cadinene（59.19±4.63%）和α-copaene（25.84±2.76%）
- CsSesquiTPS3产生74.74±1.94%的β-farnesene
- CsSesquiTPS4主要产生β-elemene（>50%），并伴有β-caryophyllene（6.22±0.50%）、α-humulene（12.68±0.60%）及多种selinene
- CsSesquiTPS5a/b产生alloaromadendrene（23.55±12.43%/25.67±10.05%）、ledene（23.88±0.80%/20.43±5.60%）和β-cadinene（25.52±6.79%/31.58±16.22%）为主要产物
- CsSesquiTPS6a仅产生β-caryophyllene，CsSesquiTPS6b产生β-caryophyllene（73.51±0.26%）和α-humulene（23.14±0.30%），CsSesquiTPS6c因D319G突变无活性
- CsSesquiTPS7产生β-caryophyllene和α-humulene（合计约75.25%）。
研究结论
甜橙拥有一个庞大且高度分化的TPS基因家族，其中55个可能具有催化功能。七个被功能表征的倍半萜合酶产生多种倍半萜产物，表明柑橘倍半萜合酶在产物多样性中起关键作用，并可能参与植物防御和香气形成。