Metabolic Engineering Strategies of Industrial Hemp (Cannabis sativa L.): A Brief Review of the Advances and Challenges
- 作者
- Michihito Deguchi, Shriya Kane, Shobha Potlakayala, Hannah George, Renata Proano, Vijay Sheri, Wayne R. Curtis, Sairam Rudrabhatla
- 单位
- The Central Pennsylvania Research and Teaching Laboratory for Biofuels, Penn State Harrisburg, Middletown, PA, United States; School of Medicine, Georgetown University, Washington, DC, United States; Department of Chemical Engineering, The Pennsylvania State University, University Park, PA, United States
- 杂志
- Frontiers in Plant Science（2020）
- DOI
- 10.3389/fpls.2020.580621
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
工业大麻（Cannabis sativa L.）的代谢工程受到再生和稳定转化效率低下的限制，且大麻素合成途径中关键酶基因功能和代谢调控机制尚未完全阐明，亟需发展高效的基因递送与编辑工具，以实现目标植化素（如CBD、CBG）的高效生产并消除精神活性成分THC。
研究策略
综述了多种代谢工程策略：靶向植化素合成途径限速酶基因（如THCAS、CBDAS）、靶向前体合成基因（如GPP合酶、AAE1/3）、通过转录因子激活途径、利用异源宿主（酵母、烟草等）生产大麻素，并重点介绍了转基因和瞬时基因递送系统，包括农杆菌浸润、dsRNA外用、CRISPR/Cas基因组编辑、碱基编辑和顺式调控元件编辑，以及利用形态发生调节因子（BBM、WUS2等）改善体细胞胚胎发生以提高再生效率。
核心内容
工业大麻富含超过540种植化素，但其代谢工程长期受制于再生效率低和基因组复杂等瓶颈。该综述系统梳理了靶向大麻素合成途径限速酶（如THCAS、CBDAS、PT4）、前体供给基因（GPP合酶、AAE1/3）以及转录因子调控等策略，并重点分析了多种基因递送与编辑工具的应用前景，包括农杆菌浸润、VIGS、dsRNA外用、CRISPR/Cas9多基因敲除、碱基编辑及顺式调控元件编辑。关键进展包括：利用VIGS可使八氢番茄红素脱氢酶基因表达降低70%；光自养微繁殖系统生根率达97.5%；在酵母等异源宿主中已实现CBDA的从头合成；单个CRISPR载体表达12个gRNA可同时敲除6个基因。为克服大麻再生障碍，作者提出将形态发生调节因子BBM、WUS2的瞬时表达与CRISPR系统偶联的策略，结合不引入外源DNA的cisgenic编辑方式，有望加速大麻素谱的精准改良，在消除THC的同时提高CBD等目标产物的积累，为工业大麻代谢工程和商业化应用提供可行路径。
创新点
提出将形态发生调节因子（如BBM、WUS2）的瞬时表达与CRISPR/Cas系统相结合来克服大麻再生障碍；通过农杆菌真空浸润实现大麻毛状体的基因过表达和沉默；利用VIGS和dsRNA外用进行瞬时基因沉默；利用CRISPR/Cas9一步敲除多个同源基因以应对大麻复杂基因组；采用碱基编辑和顺式调控元件编辑实现“精细调控”，且该cisgenic方法不引入外源基因，更易获得公众接受。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | 大麻素生物合成途径 | THCAS | 四氢大麻酚酸合酶 | 催化 | 催化大麻萜酚酸（CBGA）生成四氢大麻酚酸（THCA） |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | 大麻素生物合成途径 | CBDAS | 大麻二酚酸合酶 | 催化 | 催化CBGA生成大麻二酚酸（CBDA） |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | 大麻素生物合成途径 | PT4 (芳香族异戊烯转移酶) | 芳香族异戊烯转移酶 | 催化 | 催化橄榄醇酸与GPP缩合生成CBGA |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | 大麻素生物合成途径（前体合成） | AAE1, AAE3 | 酰基活化酶 | 催化 | 激活己酸生成己酰辅酶A，为橄榄醇酸合成提供前体 |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | MEP途径/萜类前体合成 | GPP合酶基因 | 香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP和DMAPP生成香叶基二磷酸（GPP），是CBGA合成的底物之一 |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | 大麻素生物合成途径 | TKS, OAC | 四酮合酶, 橄榄醇酸环化酶 | 催化 | 催化己酰辅酶A生成橄榄醇酸 |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | 大麻素生物合成途径调控 | MYB转录因子基因 | MYB转录因子 | 调控 | Marks等鉴定的两个MYB结构域转录因子可能调控大麻腺毛中的大麻素合成 |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | 体细胞胚胎发生 | BBM (BABY BOOM) | BABY BOOM转录因子 | 调控 | 正向调控体细胞胚胎发生，促进再生 |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | 体细胞胚胎发生 | WUS2 (WUSCHEL2) | WUSCHEL2转录因子 | 调控 | 与BBM协同增强单子叶和双子叶植物的转化与再生 |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | 体细胞胚胎发生 | CLAVATA3 | CLAVATA3 | 调控 | 负调控干细胞稳态，下调其表达可能促进体细胞胚胎发生 |
| 烟草 (Nicotiana tabacum) | 大麻素生物合成途径 | THCAS | 四氢大麻酚酸合酶 | 催化 | Sirikantaramas等将THCAS导入烟草，外源供给CBGA可合成THCA |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 大麻素生物合成途径（MEP/GPP/己酸/CBDA） | — | — | 催化 | Zirpel等和Luo等通过在酵母中引入相关途径实现了CBDA的合成 |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 大麻素生物合成途径 | — | — | 催化 | InMed Pharmaceuticals利用大肠杆菌生物发酵产酶并通过生物转化生产大麻素 |
| 莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii) | 大麻素生物合成途径 | — | NphB酶 | 催化 | Renew Biopharma使用衣藻产生大麻素，并拥有NphB酶专利 |
| 运动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis) | 大麻素生物合成途径 | — | — | 催化 | Farmako公司利用该细菌生产180种大麻素，包括THC和CBD |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | 类胡萝卜素/光合作用（非大麻素途径） | PDS, ChlI | 八氢番茄红素脱氢酶, 镁螯合酶亚基I | 催化 | Schachtsiek等用VIGS沉默这两个基因使表达降低70%，验证基因沉默体系 |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | THC合成调控 | 多种转录因子基因 | 转录因子 | 调控 | van Bakel等鉴定了几十个可能参与THC途径调控的转录因子 |
| Cannabis sativa L. (工业大麻) | 大麻素生物合成途径 | THCAS, CBDAS | 四氢大麻酚酸合酶, 大麻二酚酸合酶 | 催化 | 同时沉默THCAS和CBDAS可增加稀有大麻素CBCA的产量 |
关键发现
- 论文报道了以下具体数据：工业大麻中已鉴定超过540种植物化学物质
- Schachtsiek等利用VIGS使八氢番茄红素脱氢酶（PDS）和镁螯合酶亚基I（ChlI）基因表达降低70%
- Kodym和Leeb建立的光自养微繁殖系统生根率达97.5%
- Lata等在愈伤组织中以0.5 μM TDZ获得最高芽诱导率，Chaohua等在子叶中以2.0 μM TDZ获得最高芽诱导率
- Sirikantaramas等将THCAS基因导入烟草异源合成THCA
- Zirpel等和Luo等在酵母中通过引入MEP、GPP、己酸和CBDA合成途径实现了CBDA的合成
- 通过单个CRISPR载体表达12个gRNA可同时删除6个番茄基因
- Shen等在水稻T0代实现了8个靶基因的纯合突变
- 大麻中已基因分型超过14,000个SNP，其中多个与 cannabinoid 含量相关
- CRISPR/Cas9系统可在一步编辑中敲除多个同源基因。
研究结论
将形态发生调节因子（如BBM、WUS2）与CRISPR/Cas系统结合，有望显著提高工业大麻的体细胞胚胎发生与再生效率，从而加速大麻代谢工程。CRISPR/Cas介导的基因敲除、顺式调控元件编辑和碱基编辑是精准改良大麻植化素谱、消除THC并增加稀有大麻素（如CBCA）的可行途径，且这些cisgenic方法更易获得公众认可。未来需进一步解析大麻素合成途径基因的功能，并利用异源平台拓展大麻素的生产。