Modular 5'-UTR hexamers for context-independent tuning of protein expression in eukaryotes
- 作者
- Søren D. Petersen, Jie Zhang, Jae S. Lee, Tadas Jakočiūnas, Lise M. Grav, Helene F. Kildegaard, Jay D. Keasling, Michael K. Jensen
- 单位
- Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark; Joint BioEnergy Institute; Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley; Center for Synthetic Biochemistry, Institute for Synthetic Biology, Shenzhen Institutes of Advanced Technologies
- 杂志
- Nucleic Acids Research（2018）
- DOI
- 10.1093/nar/gky734
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
短翻译起始位点（TIS）序列在不同遗传和环境背景下是否能够可预测地调控蛋白表达，以及如何系统鉴定和验证模块化TIS六聚体。
研究策略
构建三个TIS六聚体文库（-6至-1位）置于不同启动子（REV1、RPL18B、TEF1）下控制yeGFP表达，通过FACS分选和单克隆验证筛选出8个代表性TIS，在多种启动子（TEF1、ADH2）、ORF（yeGFP、ymUKG1、mKate2）、碳源（葡萄糖、乙醇）以及酵母和CHO细胞中验证其表达调控的线性关系，并将TIS应用于ERG9和crtE基因表达调控，绘制类胡萝卜素生产与生长表型图谱。
核心内容
该研究在真核生物中系统探索了模块化翻译起始位点（TIS）六聚体作为背景无关的蛋白表达调控工具。作者在酿酒酵母中构建了覆盖约4739个TIS六聚体变体的三个文库，置于不同启动子下控制报告基因表达，通过FACS分选和单克隆验证筛选出8个代表性TIS。随后在多种启动子、ORF、碳源以及CHO细胞中验证了这些TIS调控表达的一致性，发现不同背景下荧光输出呈强线性相关（R²=0.75–0.98），且酵母与CHO间调控趋势高度一致（R²=0.98）。其中TIS序列TCGGTC在CHO细胞中使meGFP表达比常用Kozak序列强约50%。进一步将TIS应用于ERG9和crtE基因的表达调控时，β-胡萝卜素产量差异达16倍，最大比生长速率差异达50%。该工作表明模块化六聚体TIS可作为真核生物中可预测的翻译调控元件，为代谢通量优化和生产表型图谱的快速构建提供了新工具。
创新点
['首次在真核生物中系统研究最小的TIS序列空间（6 nt）在多种遗传和环境背景下的表达调控。', '鉴定出比哺乳动物常用Kozak序列更强的TIS（TCGGTC），使CHO细胞中meGFP表达提高约50%。', '将TIS用于多重基因组工程，快速绘制了类胡萝卜素生产与适应性表型图谱。']
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/类胡萝卜素合成途径 | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 催化 | FPP→角鲨烯；通过TIS调控表达以平衡类胡萝卜素分支 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | IPP/DMAPP→GGPP；受PGK1启动子和TIS调控 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 类胡萝卜素途径酶 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | crtYB | 八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶 | 催化 | 类胡萝卜素途径酶 |
| Saccharomyces cerevisiae | 报告系统 | yeGFP | 酵母增强型绿色荧光蛋白 | 催化 | 报告蛋白，用于TIS文库荧光筛选 |
| Saccharomyces cerevisiae | 报告系统 | ymUKG1 | UKG1荧光蛋白 | 催化 | 报告蛋白，用于TIS跨ORF验证 |
| Saccharomyces cerevisiae | 报告系统 | mKate2 | 红色荧光蛋白 | 催化 | 报告蛋白，用于TIS跨ORF验证 |
| CHO-S (中国仓鼠卵巢细胞) | 报告系统 | meGFP | 哺乳动物增强型绿色荧光蛋白 | 催化 | 报告蛋白，用于哺乳动物细胞TIS验证 |
| CHO-S (中国仓鼠卵巢细胞) | 报告系统 | ZsGreen1 | ZsGreen1绿色荧光蛋白 | 催化 | 报告蛋白，用于哺乳动物细胞TIS验证 |
| Saccharomyces cerevisiae | 转录调控 | TEF1 promoter | — | 调控 | 强组成型启动子，用于TIS文库 |
| Saccharomyces cerevisiae | 转录调控 | ADH2 promoter | — | 调控 | 葡萄糖抑制型启动子，用于TIS跨启动子验证 |
| Saccharomyces cerevisiae | 转录调控 | REV1 promoter | — | 调控 | 弱组成型启动子，用于TIS文库 |
| Saccharomyces cerevisiae | 转录调控 | RPL18B promoter | — | 调控 | 中等强度启动子，用于TIS文库 |
| Saccharomyces cerevisiae | 转录调控 | PGK1 promoter | — | 调控 | 强组成型启动子，用于驱动crtE表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 翻译起始调控 | TIS hexamers | — | 调控 | 5'-UTR中-6至-1位六碱基序列，如TCGGTC、TGATAT等，模块化调控翻译起始 |
关键发现
- 在酵母中构建了覆盖约4739个TIS六聚体变体的文库（REV1库1721个、RPL18B库2174个、TEF1库844个），筛选出可使蛋白表达产生近10倍变化的TIS序列
- 不同启动子、ORF和碳源背景下两两比较荧光输出呈强线性相关（R²=0.75-0.98）
- TIS TCGGTC在CHO细胞中使meGFP表达比常用Kozak序列GCCACC强约50%
- 酵母与CHO间TIS调控趋势一致（R²=0.98），meGFP与ZsGreen1两种报告基因间R²=0.91
- 将TIS用于调控ERG9和crtE表达时，β-胡萝卜素产量差异达16倍，最大比生长速率差异达50%。
研究结论
模块化六聚体TIS可作为真核生物中背景无关的翻译起始调控工具，支持可预测的蛋白表达精细调节，并可用于代谢通量优化和生产/适应性图谱的原型构建。