Balancing gene expression without library construction via a reusable sRNA pool
- 作者
- Amar Ghodasara, Christopher A. Voigt
- 单位
- Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology; Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard
- 杂志
- Nucleic Acids Research（2017）
- DOI
- 10.1093/nar/gkx530
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统多基因系统优化需要为每个系统构建昂贵且耗时的表达文库，且难以同时调控多个基因的表达水平。
研究策略
利用可程序化靶向的工程sRNA建立可重复使用的组合调控池：将标准化15nt靶序列插入目标基因5'UTR，通过不同强度启动子控制sRNA表达实现梯度抑制，并利用CombiGEM组装和条形码测序构建含约10^7种组合的sRNA池；对系统进行筛选后，根据sRNA表达水平推断各基因最优表达量，再用启动子或RBS替换硬编码该表达水平。
核心内容
本研究开发了一种无需文库构建的可重复使用sRNA组合调控池方法，用于多基因表达水平的同时优化。该方法通过将标准化的15nt靶序列插入目标基因5'UTR，使同一个预构建的sRNA池能够适用于任意目标系统；利用核酶标准化sRNA的5'端以增强启动子强度与抑制水平的相关性，并由6个正交sRNA分别受16个启动子控制，构成约10^7种组合的调控池，通过CombiGEM组装和条形码测序进行筛选。在代谢工程应用中，将sRNA池应用于大肠杆菌β-胡萝卜素合成途径，初始产量43±7 mg/L经优化后提升至200±30 mg/L，随后通过启动子替换理性重建得到160±20 mg/L的稳定产量；在遗传电路方面，原本无功能的XNOR逻辑门经优化后恢复了正确的逻辑输出。该方法避免了为每个新系统重新构建表达文库的繁琐流程，显著降低了多基因系统优化的成本和时间，为代谢工程和合成基因回路的快速优化提供了通用策略。
创新点
['无需为每个系统从头构建文库，只需将靶序列插入目标基因即可使用同一sRNA池优化任意系统', "通过核酶标准化sRNA的5'端，使启动子强度与抑制水平高度相关（相关系数显著提高）", '设计并优化了六个正交的sRNA：靶标对，均实现120-175倍抑制，且对宿主毒性低', '将sRNA池成功应用于代谢通路（β-胡萝卜素）和遗传电路（XNOR逻辑门）两类截然不同的系统']
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH10B | 全局（宿主） | — | — | — | 主要克隆与实验宿主 |
| Escherichia coli K-12 MG1655 | 全局 | — | — | — | 用于铁饥饿实验 |
| Pseudomonas protegens PF-5 | 全局 | — | — | — | 用于跨菌种sRNA活性验证 |
| Salmonella typhimurium LT2 | 全局 | — | — | — | 用于跨菌种sRNA活性验证 |
| Escherichia coli DH10B | β-胡萝卜素合成途径 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成 |
| Escherichia coli DH10B | β-胡萝卜素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli DH10B | β-胡萝卜素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 引入共轭双键生成番茄红素 |
| Escherichia coli DH10B | β-胡萝卜素合成途径 | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 将番茄红素环化为β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli DH10B | MEP途径（前体供给） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径第一个限速酶，过表达可提高类胡萝卜素产量 |
| Escherichia coli DH10B | MEP途径（前体供给） | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP互变，过表达可提升前体供应 |
| Escherichia coli DH10B | XNOR逻辑门电路 | betI | BetI抑制蛋白 | 调控 | 作为NOR门的转录抑制因子 |
| Escherichia coli DH10B | XNOR逻辑门电路 | hlyRII | HlyRII抑制蛋白 | 调控 | 作为另一个NOR门的转录抑制因子 |
| Escherichia coli DH10B | sRNA调控系统 | hfq | Hfq | 调控 | RNA伴侣蛋白，协助sRNA与靶mRNA结合，为sRNA发挥作用所必需 |
| Escherichia coli DH10B | sRNA调控系统 | sRNA-A | — | 调控 | 工程化反式作用小RNA，靶向15nt序列，可实现175倍抑制 |
| Escherichia coli DH10B | sRNA调控系统 | sRNA-B | — | 调控 | 正交sRNA之一，抑制范围约120-175倍 |
| Escherichia coli DH10B | sRNA调控系统 | sRNA-C | — | 调控 | 正交sRNA之一，抑制范围约120-175倍 |
| Escherichia coli DH10B | sRNA调控系统 | sRNA-D | — | 调控 | 正交sRNA之一，抑制范围约120-175倍 |
| Escherichia coli DH10B | sRNA调控系统 | sRNA-E | — | 调控 | 正交sRNA之一，抑制范围约120-175倍 |
| Escherichia coli DH10B | sRNA调控系统 | sRNA-F | — | 调控 | 正交sRNA之一，抑制范围约120-175倍 |
| Escherichia coli DH10B | β-胡萝卜素合成途径 / XNOR电路 | T7RNAP | T7 RNA聚合酶 | 催化 | 从单独质粒表达，IPTG诱导，用于驱动T7启动子控制的通路转录 |
关键发现
- 通过控制sRNA表达可将靶基因抑制1.6-87倍
- 最佳sRNA（sRNA-A）实现175倍抑制，六个正交sRNA的抑制范围为120-175倍
- sRNA池由6个sRNA分别受16个启动子控制，组合数约10^7
- β-胡萝卜素初始产量为43±7 mg/L，最优克隆产量达200±30 mg/L，经启动子替换重建后产量为160±20 mg/L
- XNOR电路经sRNA池优化后从无功能变为正确的逻辑输出。
研究结论
开发了一种可重复使用的sRNA池方法，通过预先构建好的调控因子库实现多基因表达的同时优化，并可据此理性替换启动子或RBS来构建最终稳定的系统，显著降低优化成本和时间，适用于代谢工程和合成基因回路等多种应用。