Efficient multiplexed gene regulation in Saccharomyces cerevisiae using dCas12a
- 作者
- Klaudia Ciurkot, Thomas E. Gorochowski, Johannes A. Roubos, René Verwaal
- 单位
- DSM Biotechnology Center; Department of Chemistry, University of Hamburg; School of Biological Sciences, University of Bristol
- 杂志
- Nucleic Acids Research（2021）
- DOI
- 10.1093/nar/gkab529
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中缺乏系统性的dCas12a-based CRISPRi设计指导，需要评估NLS位置、抑制域、gRNA靶位等关键参数，并实现多重基因调控。
研究策略
系统构建并评估dCas12a-based CRISPRi系统各设计要素，包括NLS位置、抑制域类型、gRNA靶向位置、可诱导表达及crRNA阵列的多重调控，并以β-胡萝卜素途径为应用验证。
核心内容
本研究以酿酒酵母CEN.PK113-7D为底盘，系统评估了基于dCas12a的CRISPRi系统关键设计要素，包括NLS位置、抑制域类型、gRNA靶位及crRNA阵列排列方式。通过构建报告基因体系，确定了最优配置为dCas12a E925A融合单个C端NLS及Mxi1或MIG1抑制域，对报告基因可实现最高97%的下调；基因组整合dCas12a比质粒表达抑制效率提高至少3倍，且靶向启动子区域比靶向ORF抑制更强，最强可达20倍。研究发现crRNA阵列中位于第一或第二位置的gRNA抑制效果优于第三位置，并验证了利用RNAP II启动子表达gRNA的可行性，含两个直接重复或核酶的gRNA分别实现35.7倍和41.2倍抑制。在β-胡萝卜素途径验证中，单gRNA抑制crtI可完全消除产物积累，而抑制crtE或crtYB仅部分减少产量，表明该策略能实现异源途径的精细调控。此外，高表达dCas12a对细胞有轻微毒性，可通过弱启动子PGI1缓解。该工作为酿酒酵母中dCas12a-based CRISPRi的理性设计提供了系统指导，有力支撑工业菌株的代谢工程改造。
创新点
首次在酿酒酵母中系统评估dCas12a-based CRISPRi设计规则；发现Mxi1和MIG1抑制域能显著增强抑制；发现crRNA阵列中gRNA的位置效应；展示利用RNAP II启动子实现可诱导gRNA表达；成功实现β-胡萝卜素途径的多重严格调控。
研究对象（21）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | CRISPRi | dCas12a (LbCas12a E925A) | dCas12a | 调控 | 催化失活的Cas12a，融合NLS和抑制域用于基因抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | CRISPRi | dCas12a (LbCas12a D832A) | dCas12a | 调控 | 另一种催化失活突变体，与E925A比较 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | CRISPRi | MXI1 | Mxi1 | 调控 | 抑制域，与dCas12a融合增强抑制效果 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | CRISPRi | MIG1 | Mig1 | 调控 | 抑制域，与dCas12a融合显示出与Mxi1相当的抑制效果 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | CRISPRi | KRAB | KRAB | 调控 | 抑制域，与dCas12a融合反而减弱抑制能力 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | CRISPRi | TUP1 | Tup1 | 调控 | 抑制域，与dCas12a融合减弱抑制能力 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | CRISPRi | UME6 | Ume6 | 调控 | 抑制域，无明显增强作用 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | β-胡萝卜素合成 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 来源于Xanthophyllomyces dendrorhous，催化FPP→GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | β-胡萝卜素合成 | crtYB | 番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶 | 催化 | 双功能酶，来源于Xanthophyllomyces dendrorhous |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | β-胡萝卜素合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来源于Xanthophyllomyces dendrorhous，催化八氢番茄红素转化为番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 荧光报告 | eGFP | eGFP | 调控 | 报告基因，用于评估CRISPRi效率 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 荧光报告 | mCherry | mCherry | 调控 | 报告基因，用于多重调控和生长测量 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 荧光报告 | BFP | BFP | 调控 | 报告基因，用于多重调控 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | gRNA表达 | SNR52 | — | 调控 | RNAP III启动子，用于表达crRNA |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | gRNA表达 | GAL10 | — | 调控 | RNAP II启动子，可诱导表达gRNA |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | gRNA表达 | SUP4 | — | 调控 | 终止子，用于crRNA表达 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 异源启动子 | Sbay_TDH3p | — | 调控 | 来自Saccharomyces bayanus的TDH3启动子，控制eGFP或crtE表达 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 异源启动子 | Smik_TEF1p | — | 调控 | 来自Saccharomyces mikatae的TEF1启动子，控制mCherry或crtYB表达 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 异源启动子 | KLENO1p | — | 调控 | 来自Kluyveromyces lactis的ENO1启动子，控制BFP或crtI表达 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | 核定位 | SV40 NLS | — | 调控 | 核定位信号，融合位置影响dCas12a效率 |
| Escherichia coli NEB 10-beta | 质粒扩增 | — | — | 调控 | 用于质粒构建和扩增 |
关键发现
- 最优系统为dCas12a E925A融合单个C端NLS及Mxi1或MIG1抑制域，对报告基因最高可实现97%的下调
- 基因组整合dCas12a比质粒表达至少提高3倍抑制效率
- 靶向启动子比靶向ORF抑制更强，最强可达20倍抑制（KLENO1启动子gENO3）
- RNAP II启动子表达gRNA时，含两个直接重复或核酶的gRNA分别实现35.7±3.7倍和41.2±3倍抑制
- crRNA阵列中位于第一或第二位置的gRNA比第三位置抑制更强
- 单gRNA抑制crtI可完全消除β-胡萝卜素产生，而抑制crtE或crtYB时β-胡萝卜素减少但仍可检测
- 高表达dCas12a对细胞有轻微毒性，可用弱启动子PGI1缓解。
研究结论
dCas12a-based CRISPRi系统在酿酒酵母中可实现高效、可诱导的多重基因调控，通过优化NLS、抑制域及crRNA阵列设计，可严格调控异源代谢途径，为工业菌株代谢工程提供了有力工具。