DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways
- 作者
- Zengyi Shao, Hua Zhao, Huimin Zhao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign; Department of Chemistry, Biochemistry, and Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign; Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign
- 杂志
- Nucleic Acids Research（2009）
- DOI
- 10.1093/nar/gkn991
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统多步、顺序克隆方法在构建大片段生化途径时耗时、低效且受限于酶切位点，需要一种快速、一步式组装方法。
研究策略
利用酿酒酵母体内高效的同源重组机制，将多个基因表达盒与线性化载体或染色体靶向片段共转化，通过重叠序列在一体内一步组装完整生化途径。
核心内容
该研究报道了一种名为DNA assembler的体内遗传组装方法，利用酿酒酵母高效的同源重组机制，将多个基因表达盒与线性化载体共转化，通过重叠序列一步组装完整生化途径，无需体外连接和限制性酶切。研究人员成功构建了D-木糖利用途径（约9 kb，3个基因）、玉米黄质合成途径（约11 kb，5个基因）以及两者组合的八基因途径（约19 kb），组装效率在短途径中达到70-100%，长途径为40-70%；使用50 bp重叠序列时，三基因途径在质粒和染色体上的效率分别达100%和80%。功能验证显示，重组酵母能以D-木糖为唯一碳源生长，HPLC在19.9分钟检测到玉米黄质特征峰，而对照无此峰。此外，增大插入片段与载体比例可将八基因途径的组装效率从20%提升至70%。该方法为合成生物学和代谢工程提供了一种快速、通用的多基因途径构建工具，并有望扩展至更大DNA分子甚至基因组的组装。
创新点
首次实现酵母体内同源重组一步组装多基因生化途径；既可组装到质粒也可整合到染色体；无需体外连接和限制性内切酶，仅需简单的DNA制备和一步酵母转化。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | D-木糖利用途径 | XR | 木糖还原酶 (xylose reductase) | 催化 | 来源于Neurospora crassa |
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | D-木糖利用途径 | XDH | 木糖醇脱氢酶 (xylitol dehydrogenase) | 催化 | 来源于Neurospora crassa |
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | D-木糖利用途径 | XKS | 木酮糖激酶 (xylulokinase) | 催化 | 来源于Pichia stipitis |
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | 玉米黄质生物合成途径 | CrtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 (geranylgeranyl pyrophosphate synthase) | 催化 | 来源于Erwinia uredovora |
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | 玉米黄质生物合成途径 | CrtB | 八氢番茄红素合酶 (phytoene synthase) | 催化 | 来源于Erwinia uredovora |
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | 玉米黄质生物合成途径 | CrtI | 八氢番茄红素脱氢酶 (phytoene desaturase) | 催化 | 来源于Erwinia uredovora |
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | 玉米黄质生物合成途径 | CrtY | 番茄红素环化酶 (lycopene cyclase) | 催化 | 来源于Erwinia uredovora |
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | 玉米黄质生物合成途径 | CrtZ | β-胡萝卜素羟化酶 (beta-carotene hydroxylase) | 催化 | 来源于Erwinia uredovora |
关键发现
- 构建了D-木糖利用途径（约9 kb，3个基因）、玉米黄质合成途径（约11 kb，5个基因）及组合途径（约19 kb，8个基因），组装效率70-100%（短途径）和40-70%（长途径）
- 使用50 bp overlap时三基因途径效率达100%（质粒）和80%（染色体）
- 八基因途径在125-430 bp overlap时效率达40-70%
- 重组酵母能以D-木糖为唯一碳源生长，HPLC检测到玉米黄质峰（19.9 min），对照无此峰
- 增大插入片段与载体比例可将八基因途径（50 bp overlap）效率从20%提至70%。
研究结论
DNA assembler是一种快速、高效、通用的生化途径构建方法，适用于合成生物学、代谢工程和功能基因组学研究，并有可能组装更大的DNA分子甚至整个基因组。