高级醇 · 代谢工程文献库

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Regulation of Sesquiterpene Cyclase Gene Expression: Characterization of an Elicitor- and Pathogen- Inducible Promoter

作者
Shaohui Yin, Leng Mei, Jeffrey Newman, Kyoungwhan Back, Joe Chappell
单位
Plant Physiology/Biochemistry/Molecular Biology Program, University of Kentucky, Lexington, Kentucky 40546-0091
杂志
Plant Physiology（1997）
DOI
10.1104/pp.115.2.437
所属领域
代谢工程
关键词
EAS4 promoterGUSelicitor-induciblepathogen-induciblephytoalexinsesquiterpene cyclasetobaccotranscriptional regulation
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解决的核心问题

解析烟草倍半萜环化酶基因EAS4启动子的调控机制，明确其在激发子/病原菌诱导的倍半萜植保素生物合成中的表达调控规律及顺式作用元件。

研究策略

将EAS4启动子与GUS报告基因融合，通过农杆菌介导的稳定转化和电穿孔瞬时表达，结合5'缺失和功能获得分析，在烟草植株、组织和原生质体中检测GUS活性，并考察SA、MJ、H2O2等信号分子的影响。

研究路线图

100%
研究问题：解析EAS4启动子调控机制
策略：启动子-GUS融合 + 5'缺失分析 + 瞬时/稳定表达
关键改造：构建EAS4启动子系列5'端缺失体
结果1：时空表达模式（叶片12-18h峰值，茎/根15倍诱导）
结果2：病原菌诱导差异（细菌5.4倍，真菌7.4/6.6倍）
结果3：缺失分析定位调控元件（-160至-1148区域）
结果4：不响应SA/MJ/H2O2（MJ抑制至25-40%）
结论：严格病原诱导型启动子，可用于抗病基因工程
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核心内容

该研究系统解析了烟草倍半萜环化酶基因EAS4启动子的表达调控机制。通过将EAS4启动子与GUS报告基因融合，利用农杆菌介导的稳定转化和电穿孔瞬时表达体系，在烟草植株、组织和原生质体中检测不同激发子和病原菌处理下的启动子活性。结果表明，EAS4启动子是严格的激发子/病原菌诱导型启动子：Cryptogein处理后叶片中GUS活性在12–18小时达到峰值，茎和根中诱导约15倍；细菌和真菌感染分别诱导5.4倍和7.4倍。5'缺失分析将调控元件定位于-160至-1148区域，其中缺失至-567和-212时诱导活性分别降至全长的50%和10%，缺失至-115后完全丧失诱导性，提示该区域包含增强型定量元件和调控诱导性的定性元件。值得注意的是，水杨酸、茉莉酸甲酯和过氧化氢不能诱导该启动子，茉莉酸甲酯反而抑制活性至对照的25–40%，表明其调控机制不同于已知的防御基因启动子。该启动子特异且严格的诱导特性使其具有应用于病原菌特异性抗病基因工程的潜力。

创新点

首次系统表征了EAS4启动子的时空表达模式，证明其是严格的病原菌/激发子诱导型启动子，不响应SA和MJ，且缺失分析鉴定出多个定量和定性调控元件，揭示了其与已知防御基因启动子不同的调控机制。

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
烟草（Nicotiana tabacum） 倍半萜植保素生物合成 EAS4 5-epi-aristolochene synthase (EAS) 催化 倍半萜环化酶，催化FPP环化生成5-epi-aristolochene，是莨菪烷类植保素capsidiol生物合成的关键调控步骤。
烟草转基因植株 报告基因表达 GUS β-葡萄糖醛酸酶 催化 作为报告基因，用于检测EAS4启动子的表达模式。
烟草悬浮细胞 倍半萜植保素生物合成 EAS4 EAS 催化 用于研究环化酶蛋白和mRNA的诱导动力学。
Nicotiana edwardsonii原生质体 瞬时表达 EAS4启动子-GUS融合 GUS 催化 利用电穿孔进行瞬时表达分析，验证启动子诱导活性。
烟草 倍半萜植保素生物合成 EAS3 EAS 催化 EAS4的旁系同源基因，其启动子不响应激发子，作为阴性对照。

关键发现

  1. Cryptogein处理下，GUS活性在叶片中12-18 h达到最大，与内源环化酶蛋白积累一致
  2. 在茎和根中elicitor处理导致GUS活性约15倍诱导。细菌P. syringae pv syringae 61感染诱导GUS活性5.4倍，其hrpH突变体诱导2.9倍
  3. 真菌P. parasitica race 0和race 1分别诱导7.4倍和6.6倍。5'缺失分析表明，缺失至-567使诱导GUS活性降至全长的50%，缺失至-212降至约10%，缺失至-160降至2%但仍保留诱导性
  4. 缺失至-115和-63则完全丧失诱导性。SA、MJ和H2O2不能显著诱导EAS4启动子，MJ反而抑制其活性至水对照的25-40%。

研究结论

EAS4启动子是一个严格且特异的激发子/病原菌诱导型启动子，其调控元件分布在-160至-1148区域内，包括增强型定量元件和调控诱导性的定性元件，该启动子具有用于病原菌特异性抗病基因工程的潜力。