A heteromeric membrane- bound prenyltransferase complex from Humulus lupulus catalyzes three sequential aromatic prenylations in the bitter acid pathway
- 作者
- Haoxun Li, Zhaonan Ban, Hao Qin, Liya Ma, Andrew J. King, Guodong Wang
- 单位
- State Key Laboratory of Plant Genomics and National Center for Plant Gene Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; Centre for Novel Agricultural Products, Department of Biology, University of York, York YO10 5DD, United Kingdom; Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
- 杂志
- Plant Physiology（2015）
- DOI
- 10.1104/pp.114.253682
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析啤酒花苦味酸生物合成途径中三个连续芳香异戊烯基化步骤的酶学基础，特别是负责第二和第三步异戊烯基化的酶。
研究策略
利用酵母异源表达系统对啤酒花腺毛cDNA文库中的芳香异戊烯基转移酶候选基因进行功能鉴定，结合定点突变、膜酵母双杂交、免疫共沉淀和体外生化实验，证明PT1L与PT2形成异源膜结合复合体催化三步异戊烯基化。
核心内容
该研究解析了啤酒花苦味酸生物合成途径中三个连续芳香异戊烯基化步骤的酶学基础。通过在酿酒酵母DD104菌株中异源表达候选基因，结合定点突变、膜酵母双杂交、免疫共沉淀和体外生化实验，证明HIPT1L与HIPT2形成异源膜结合复合体，共同催化三步异戊烯基化反应。突变实验表明PT1L负责第一步，PT2负责第二、三步。体外动力学显示复合体对底物PIVP的Vmax达7.96 μmol/mg/min，比单独PT1L高约7倍，且Km相近，说明复合体形成显著提升催化效率。在酵母中共表达PT1L-At/PT2-At最高产生总异戊烯基化酰基间苯三酚10.8 μmol/L/OD，其中总β-酸达0.37 μmol/L/OD，而截短版本PT1L-T/PT2-T共表达使总β-酸产量提高至2.18 μmol/L/OD。该研究首次报道植物中形成异源复合体的膜结合芳香异戊烯基转移酶代谢复合体，并在酵母中成功重建β-苦味酸生物合成途径，为高值异戊烯基化天然产物的代谢工程提供了新工具。
创新点
['首次报道植物中形成异源复合体的膜结合芳香异戊烯基转移酶代谢复合体（metabolon）', '在酵母中成功重建β-苦味酸生物合成途径，实现苦味酸异源生产', '阐明PT1L和PT2各自负责的异戊烯基化步骤']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母DD104 | 苦味酸生物合成途径 | HIPT1L | PT1L | 催化 | 催化第一步异戊烯基化；与PT2形成异源复合体；具有质体信号肽和两个Asp富集基序 |
| 酿酒酵母DD104 | 苦味酸生物合成途径 | HIPT2 | PT2 | 催化 | 催化第二、三步异戊烯基化；与PT1L形成异源复合体 |
| 酿酒酵母DD104 | 苦味酸生物合成途径 | HICCL2/HICCL4 | CCL2/CCL4 | 催化 | 支链短链脂肪酸CoA连接酶，参与苦味酸前体合成 |
| 酿酒酵母DD104 | 苦味酸生物合成途径 | HIVPS | VPS | 催化 | 缬草苯乙酮合酶，催化酰基间苯三酚骨架形成 |
| 酿酒酵母YPH499/DD104 | 黄酮类异戊烯基化 | SfN8DT-1 | SfN8DT-1 | 催化 | 来源于苦参的柚皮素8-异戊烯基转移酶，用于酵母菌株筛选 |
关键发现
- ['DD104菌株中8-二甲烯丙基柚皮素转化率比YPH499提高44倍（14.52% vs
- 33%）', '共表达PT1L-At/PT2-At最高产生总异戊烯基化酰基间苯三酚10.8 μmol/L/OD，其中MD-
- 54、G-
- 72、DD-
- 17、总β-酸0.37 μmol/L/OD', '截短PT1L-T/PT2-T共表达产生总β-酸2.18 μmol/L/OD', 'PT1L单独表达产生4.38 μmol/L/OD酰基间苯三酚、0.11 μmol/L/OD MD-、0.026 μmol/L/OD G-，PT2单独不产生异戊烯基化产物', '突变实验表明PT1L负责第一步，PT2负责第二、三步', '体外动力学显示PT1L/PT2复合体对PIVP的Vmax为7.96 μmol/mg/min，比PT1L-T（1.08）高约7倍，Km相近', '酵母双杂交和共免疫沉淀证实PT1L与PT2直接相互作用']
研究结论
本研究揭示啤酒花中HIPT1L与HIPT2形成异源膜结合异戊烯基转移酶复合体，催化β-苦味酸途径中三个连续异戊烯基化步骤，并成功在酵母中重建该途径，为高值异戊烯基化天然产物的代谢工程和合成生物学研究提供工具。