The phenylpropanoid pathway is controlled at different branches by a set of R2R3-MYB C2 repressors in grapevine
- 作者
- Erika Cavallini, José Tomás Matus, Laura Finezzo, Sara Zenoni, Rodrigo Loyola, Flavia Guzzo, Rudolf Schlechter, Agnès Ageorges, Patricio Arce-Johnson, Giovanni Battista Tornielli
- 单位
- Department of Biotechnology, University of Verona; Center for Research in Agricultural Genomics-CSIC-IRTA-UAB-UB; Departamento de Fruticultura y Enologia, Pontificia Universidad Católica de Chile; Departamento de Genética Molecular y Microbiología, Pontificia Universidad Católica de Chile; INRA, UMR1083 SPO
- 杂志
- Plant Physiology（2015）
- DOI
- 10.1104/pp.114.256172
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析葡萄(Vitis vinifera)中R2R3-MYB C2抑制因子家族的四个成员(VvMYB4a、VvMYB4b、VvMYBC2-L1、VvMYBC2-L3)如何在苯丙烷代谢途径的不同分支水平发挥负调控作用，以及它们在器官发育和环境响应中的特定生理功能。
研究策略
系统克隆并鉴定葡萄C2抑制因子分支的四个MYB抑制因子；通过矮牵牛异源稳定表达、烟草和葡萄瞬时共表达、葡萄毛状根同源过表达等体系进行功能验证；结合LC-MS代谢物谱、Nimblegen全基因组转录组芯片、酵母双杂交、UV-B处理及双荧光素酶报告实验，综合解析各抑制因子的调控靶点和分子机制。
核心内容
该研究系统解析了葡萄中四个R2R3-MYB C2抑制因子（VvMYB4a、VvMYB4b、VvMYBC2-L1、VvMYBC2-L3）对苯丙烷代谢途径分支的差异化负调控机制。通过矮牵牛异源表达、葡萄瞬时表达和毛状根同源过表达等体系，结合转录组、代谢物谱及酵母双杂交实验发现，VvMYB4a和VvMYB4b主要抑制PAL、C4H等通用苯丙烷基因，降低小分子酚类含量；而VvMYBC2-L1和VvMYBC2-L3则特异性下调CHS、DFR及调控因子AN2等，显著抑制花青素和原花青素积累。其中VvMYBC2-L3在葡萄毛状根中过表达使原花青素含量从2.53 mg/g FW降至0.70 mg/g FW，并鉴定到124个下游调控基因。研究还首次在葡萄中发现TLLLFR（C5）抑制基序，并证明MYB4b可与bHLH因子互作而MYB4a不能。这些发现揭示了C2抑制因子通过差异靶标选择和与bHLH的互作，在器官发育和UV-B胁迫下精确调控苯丙烷途径不同分支的代谢输出。
创新点
['首次系统表征葡萄C2抑制因子分支成员对苯丙烷途径不同分支的差异化负调控功能', '在葡萄R2R3-MYB蛋白中首次鉴定到TLLLFR(C5)抑制基序，该基序此前仅见于单R重复抑制因子AtMYBL2', '发现VvMYBC2-L3在葡萄毛状根中过表达可通过下调结构基因和调控基因显著抑制原花青素积累，并揭示其受MYBC2-L1等调控因子构成的层级调控网络', '证明亚枝A成员(MYB4a/MYB4b)与亚枝D成员(MYBC2-L1/MYBC2-L3)在调控苯丙烷途径时具有不同靶标选择性，且MYB4b能与bHLH因子互作而MYB4a不能']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Petunia hybrida (V30xM1) | 苯丙烷代谢途径(小分子酚类合成) | VvMYB4a | VvMYB4a (R2R3-MYB C2抑制因子, 251 aa) | 调控 | 异源稳定表达下调PAL/C4H/4CL并减少花瓣羟基肉桂酸衍生物，对花青素无显著影响，不能与PhAN1/VvMYC1互作 |
| Petunia hybrida (V30xM1) | 苯丙烷代谢途径(小分子酚类合成) | VvMYB4b | VvMYB4b (R2R3-MYB C2抑制因子, 242 aa) | 调控 | 异源表达同时降低羟基肉桂酸和苯甲酸衍生物，与PhAN1和VvMYC1均强互作，偶见花瓣边缘白化 |
| Petunia hybrida (V30xM1) | 类黄酮代谢(花青素/原花青素合成) | VvMYBC2-L1 | VvMYBC2-L1 (R2R3-MYB C2抑制因子, TLLLFR/C5基序) | 调控 | 异源表达显著降低花瓣花青素和种子原花青素，提高花瓣pH，下调AN2/PH4/AN1及CHS/DFR/PH5，与PhAN1强互作 |
| Petunia hybrida (V30xM1) | 类黄酮代谢(花青素/原花青素合成) | VvMYBC2-L3 | VvMYBC2-L3 (R2R3-MYB C2抑制因子, TLLLFR/C5基序) | 调控 | 异源表达导致花瓣几乎完全丧失色素并显著提高pH，种子原花青素大幅降低，是作用最强的花青素抑制因子之一 |
| Vitis vinifera (cv. Sultana) | 花青素合成途径 | MYBA1 | MYBA1 (花青素途径R2R3-MYB激活因子) | 调控 | 瞬时过表达诱导茎中花青素积累和UFGT表达，与MYBC2-L1共表达时该效应被抵消 |
| Vitis vinifera (cv. Sultana) | 花青素合成途径 | UFGT | UFGT (UDP-葡萄糖:类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶) | 催化 | MYBA1直接靶标；被MYBC2-L1强烈抑制，MYB4a无抑制作用；双荧光素酶实验证实MYBC2-L1抑制MYBA1/MYC1对其启动子的激活 |
| Vitis vinifera (cv. Maccabeu) | 原花青素合成途径 | VvMYBC2-L3 | VvMYBC2-L3 (R2R3-MYB C2抑制因子) | 调控 | 毛状根同源过表达(185倍/181倍)使PA含量从2.53降至0.70-0.77 mg/g FW，转录组鉴定出107个下调基因 |
| Vitis vinifera (cv. Maccabeu) | 类黄酮/原花青素合成途径 | MYBPA1/MYB5a/MYC1/LAR/ANR/MATE1/MATE2 | MYBPA1、MYB5a (MYB激活因子)；MYC1 (bHLH)；LAR、ANR (氧化还原酶)；MATE1/2 (转运蛋白) | 调控 | MYBC2-L3过表达毛状根中这些原花青素与类黄酮相关基因均显著下调，其中MYC1/MYBPA1/ANR/LDOX/MATE2经qPCR验证 |
| Saccharomyces cerevisiae (酵母双杂交) | 类黄酮MYB-bHLH互作网络 | PhAN1/VvMYC1 | PhAN1 (矮牵牛bHLH)、VvMYC1 (葡萄bHLH) | 调控 | MYB4b与两者均强互作；MYBC2-L1和MYBC2-L3与PhAN1强互作但与VvMYC1弱互作；MYB4a无互作 |
| Nicotiana benthamiana | 花青素合成途径 | VvMYBC2-L1 | VvMYBC2-L1 (R2R3-MYB C2抑制因子) | 调控 | 农杆菌浸润双荧光素酶实验证明MYBC2-L1显著抑制MYBA1/MYC1介导的UFGT启动子激活 |
| Vitis vinifera (cv. Sultana) | 苯丙烷代谢(小分子酚类合成) | CCoAOMT | CCoAOMT (咖啡酰辅酶A 3-O-甲基转移酶) | 催化 | MYB4a和MYBC2-L1瞬时表达均抑制其表达，与MYB4a在表达谱聚类中高度相关 |
| Vitis vinifera (cv. Cabernet Sauvignon/Sultana) | 苯丙烷代谢途径 | PAL/C4H/4CL/COMT | PAL (苯丙氨酸解氨酶)、C4H (肉桂酸4-羟化酶)、4CL (4-香豆酸CoA连接酶)、COMT (咖啡酸3-O-甲基转移酶) | 催化 | UV-B处理后C4H/4CL/COMT/CCoAOMT显著上调；矮牵牛中MYB4a/4b强下调PAL/C4H/4CL而MYBC2-L1/L3主要下调C4H |
关键发现
- ['VvMYB4a、VvMYB4b、VvMYBC2-L1、VvMYBC2-L2、VvMYBC2-L3分别编码251、242、225、226、228个氨基酸残基的蛋白，MYB4a与MYB4b一致性为75%', '矮牵牛异源表达结果表明，VvMYB4a和VvMYB4b抑制PAL、C4H、4CL等通用苯丙烷基因的表达，显著降低花瓣中羟基肉桂酸衍生物等小分子酚类化合物含量，但对花青素积累和花瓣pH无显著影响
- MYB4b还降低苯甲酸衍生物含量', 'VvMYBC2-L1和VvMYBC2-L3在矮牵牛中强烈下调CHS、DFR、PH5以及调控因子AN2、PH4、AN1，导致花瓣花青素含量显著降低(尤其MYBC2-L3几乎完全丧失色素)和花瓣粗提液pH显著升高，种子原花青素含量也显著下降', '在Sultana葡萄幼苗瞬时表达中，MYBC2-L1抑制MYBA1介导的UFGT表达和花青素积累，而MYB4a无此作用
- MYB4a和MYBC2-L1均抑制CCoAOMT表达', '双荧光素酶实验证实MYBC2-L1能显著降低MYBA1/MYC1对UFGT启动子的激活，而MYB4a无影响', '酵母双杂交显示MYB4b与PhAN1及VvMYC1均强互作，MYBC2-L1和MYBC2-L3与PhAN1强互作但与VvMYC1仅弱互作，MYB4a则不能与二者互作', '低通量UV-B(15 μW/cm²，剂量1.6 J/cm²/d)照射6小时后MYB4a和MYB4b显著下调，而C4H、4CL、COMT、CCoAOMT显著上调', 'VvMYBC2-L3在葡萄毛状根中过表达(表达量为对照的185倍和181倍)使原花青素含量从对照的2.53 mg/g FW降至0.70和0.77 mg/g FW', '转录组分析(SAM)共鉴定出124个受MYBC2-L3调控的基因，其中107个下调、17个上调，包括PAL、CHS1/2/3、F3H1、LAR、ANR、LDOX、MATE1/2、GT1/2/3等结构基因及MYBPA1、MYB5a、MYC1、MYBC2-L1、MYB4a等调控基因']
研究结论
葡萄C2抑制因子家族通过负调控苯丙烷代谢途径的不同分支实现特定代谢输出：VvMYB4a和VvMYB4b主要抑制小分子酚类物质合成，而VvMYBC2-L1和VvMYBC2-L3则额外精细调控类黄酮(花青素和原花青素)水平，通过与bHLH因子的差异互作及对结构基因和调控基因的双重抑制，平衡由MBW激活复合物介导的诱导效应，从而在器官发育和UV-B等环境胁迫下实现苯丙烷途径的精确时空调控。