Hypoosmotic Expression of Dunaliella bardawil ζ-Carotene Desaturase Is Attributed to a Hypoosmolarity-Responsive Element Different from Other Key Carotenogenic Genes
- 作者
- Yong-Min Lao, Lan Xiao, Li-Xin Luo, Jian-Guo Jiang
- 单位
- College of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China; School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China
- 杂志
- Plant Physiology（2014）
- DOI
- 10.1104/pp.114.235390
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析杜氏盐藻（Dunaliella bardawil）ζ-胡萝卜素脱饱和酶基因（Dbzds）启动子中响应低渗胁迫的顺式作用元件，阐明其与其他关键类胡萝卜素基因（Dbpsy、Dbpds、DblcyB1、DblcyB2）在盐胁迫下差异表达调控的机制。
研究策略
分离Dbzds启动子并进行生物信息学分析，构建由野生型、HRE缺失、GBF5BS缺失及HRE-GBF5BS同时缺失的启动子驱动ble-egfp融合基因的载体，转化D. bardawil，在0~4.5 M NaCl条件下检测内源Dbzds及外源报告基因的转录水平，并与其它类胡萝卜素基因的表达谱和启动子调控元件进行比较。
核心内容
该研究以杜氏盐藻（Dunaliella bardawil）为对象，解析了ζ-胡萝卜素脱饱和酶基因（Dbzds）启动子中响应低渗胁迫的顺式作用元件，并比较了其与类胡萝卜素途径其他关键基因的盐胁迫调控差异。研究者分离了长2,899 bp的Dbzds启动子，构建了缺失低渗响应元件（HRE，核心序列ACTCATCCT）或GBF5BS的启动子驱动ble-egfp报告基因的载体并转化杜氏盐藻，在0至4.5 M NaCl条件下检测转录水平。结果发现，低渗（0 M NaCl）时内源Dbzds表达最高，2 M NaCl时降至约34%；报告基因受野生型启动子驱动时呈现一致趋势，而删除HRE后低渗表达完全丧失，2 M NaCl下转录反而升高至0 M的1.61倍，删除GBF5BS则不影响表达模式，表明HRE是低渗响应所必需的核心元件。此外，Dbpsy在4.5 M NaCl时转录显著升高，DblcyB1在3 M NaCl时上调，Dbpds则基本不变，提示各基因对盐胁迫的差异响应与其启动子及内含子调控序列架构密切相关。该研究首次明确了Dbzds低渗表达的特异性顺式元件，为理解杜氏盐藻类胡萝卜素基因的差异化盐胁迫调控机制提供了分子证据。
创新点
['首次发现并验证Dbzds启动子中的低渗响应元件（HRE，核心序列ACTCATCCT）单独负责Dbzds的低渗表达，而不是GBF5BS', '揭示了不同类胡萝卜素基因在盐胁迫下的差异诱导特性与其启动子调控序列架构（如GT-1基序、HRE、内含子GT富集区）相关', '采用启动子缺失突变结合报告基因系统在D. bardawil中验证了顺式元件的功能']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Dunaliella bardawil | 类胡萝卜素生物合成 | Dbzds | ζ-胡萝卜素脱饱和酶（ZDS） | 催化 | 受启动子HRE（ACTCATCCT）调控，低渗诱导表达 |
| Dunaliella bardawil | 类胡萝卜素生物合成 | Dbpsy | 八氢番茄红素合酶（PSY） | 催化 | 盐胁迫（高渗）诱导表达，启动子含GT-1基序 |
| Dunaliella bardawil | 类胡萝卜素生物合成 | Dbpds | 八氢番茄红素脱饱和酶（PDS） | 催化 | 对盐胁迫不敏感，表达水平基本恒定 |
| Dunaliella bardawil | 类胡萝卜素生物合成 | DblcyB1 | 番茄红素β-环化酶（LYCB1） | 催化 | 盐胁迫诱导，启动子含GT-1基序 |
| Dunaliella bardawil | 类胡萝卜素生物合成 | DblcyB2 | 番茄红素β-环化酶（LYCB2） | 催化 | 大多数盐浓度下组成型表达，4.5 M NaCl时诱导，第一内含子含GT富集区 |
关键发现
- ['Dbzds基因全长6,879 bp，含12个外显子和11个内含子，启动子长2,899 bp，HRE位于-785（核心序列ACTCATCCT），GBF5BS位于-484（ATGAGT）', '在0 M NaCl（低渗）条件下Dbzds转录水平最高，2 M NaCl时降至约34.46%，表明Dbzds受低渗诱导', 'ble-egfp受野生型Dbzds启动子驱动时，1 M NaCl下转录水平约为0 M的0.2384倍，2 M时约为34.91%，与内源Dbzds表达趋势一致', '删除HRE后（pDBET1），0 M NaCl下的低渗表达丧失，2 M NaCl时转录反而为0 M的1.6121倍
- 删除GBF5BS（pDBET2）不影响表达模式，同时删除HRE和GBF5BS（pDBET3）与删除HRE效果相似', 'Dbpsy在4.5 M NaCl时转录显著升高，DblcyB1在3 M NaCl明显上调，DblcyB2在大多数盐浓度下维持基础水平（4.5 M时也显著诱导），Dbpds在所有盐浓度下基本不变', '培养物在5 mM KNO3充足硝酸盐条件下，细胞生长较文献中硝酸盐限制条件高10-20倍']
研究结论
D. bardawil的Dbzds基因受低渗胁迫调控，其启动子中的HRE（ACTCATCCT）是负责该低渗响应所必需的核心顺式元件，GBF5BS不起关键作用；不同类胡萝卜素基因（Dbpsy、Dbpds、DblcyB1、DblcyB2）对盐胁迫的差异表达与各自启动子及内含子中的调控序列架构密切相关。