In vivo and in vitro studies on the carotenoid cleavage oxygenases from Sphingopyxis alaskensis RB2256 and Plesiocystis pacifica SIR-1 revealed their substrate specificities and non-retinal-forming cleavage activities
- 作者
- Jana Hoffmann, Judit Bóna-Lovász, Holger Beuttler, Josef Altenbuchner
- 单位
- Institute of Industrial Genetics, University of Stuttgart, Germany; Institute for System Dynamics, University of Stuttgart, Germany; Institute of Technical Biochemistry, University of Stuttgart, Germany
- 杂志
- FEBS Journal（2012）
- DOI
- 10.1111/j.1742-4658.2012.08751.x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明来自Sphingopyxis alaskensis RB2256和Plesiocystis pacifica SIR-1的推定的类胡萝卜素裂解加氧酶的功能、底物特异性及其是否形成视网膜。
研究策略
采用基因组数据库搜索发现候选基因，在大肠杆菌JM109中异源表达并共表达不同类胡萝卜素生物合成基因以产生底物，通过体内漂白实验、体外纯化酶动力学分析和产物LC-MS鉴定，以及全细胞催化等策略研究酶学性质。
核心内容
本研究从Sphingopyxis alaskensis RB2256和Plesiocystis pacifica SIR-1基因组中挖掘到推定类胡萝卜素裂解加氧酶基因sala_1698（SaCCO）和ppsir1_15490（PpCCO），并在大肠杆菌JM109中异源表达，结合类胡萝卜素生物合成基因共表达、体内漂白、体外酶动力学与LC-MS产物鉴定等方法系统表征其功能。结果显示，SaCCO在体内裂解番茄红素及羟基化衍生物，诱导表达使番茄红素含量从对照的1.45 μg/5×10^9细胞降至0.04 μg；纯化酶体外可作用于apo-8'-胡萝卜素醛的9'/10'和11'/12'双键，后者为首次报道的裂解位点，动力学参数Km为122.9±18.5 μM，kcat/Km为39.9±7.0 nM⁻¹·s⁻¹，FeSO₄使活性提升约1.5倍。PpCCO特异性裂解含羟基或酮基的C40及C50类胡萝卜素，全细胞催化鉴定出canthaxanthin、zeaxanthin等在11'/12'或13'/14'双键切割，astaxanthin仅于13'/14'切割，产物包括apo-13'-canthaxanthinone（m/z 273.0）等。两种酶均不生成视网膜，sala_1008和ppsir1_17230无裂解活性。该工作揭示了非视网膜形成型裂解加氧酶的底物选择与位点偏好，为微生物定向生产类胡萝卜素衍生物提供了新酶工具。
创新点
首次表征了SaCCO和PpCCO的底物特异性，发现SaCCO可裂解11'/12'双键（此前未见报道），PpCCO特异性作用于含羟基或酮基的类胡萝卜素，且两者均不形成视网膜。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素裂解 | sala_1698 | SaCCO | 催化 | 源自Sphingopyxis alaskensis RB2256，在体内裂解无环和单环类胡萝卜素，体外裂解apo-8'-carotenal的9'/10'和11'/12'双键。 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素裂解 | ppsir1_15490 | PpCCO | 催化 | 源自Plesiocystis pacifica SIR-1，需要底物含羟基或酮基，裂解C40/C50类胡萝卜素；全细胞催化时对astaxanthin在13'/14'双键单一切割，对zeaxanthin等有11'/12'或13'/14'双键切割。 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素裂解 | sala_1008 | Sala_1008 | 催化 | 来自S. alaskensis RB2256，实验未检测到类胡萝卜素裂解活性。 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素裂解 | ppsir1_17230 | Ppsir1_17230 | 催化 | 来自P. pacifica SIR-1，实验未检测到类胡萝卜素裂解活性。 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | crtC | CrtC | 催化 | 来自P. pacifica SIR-1，用于产生羟基番茄红素和二羟基番茄红素底物。 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | crtEb, crtYe, crtYf | CrtEb, CrtYe, CrtYf | 催化 | 来自Corynebacterium glutamicum，用于合成C50类胡萝卜素（decaprenoxanthin等）。 |
| Sphingopyxis alaskensis RB2256 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB, crtE, crtG, crtI, crtY, crtZ | CrtB, CrtE, CrtG, CrtI, CrtY, CrtZ | 催化 | 基因组预测与nostoxanthin合成相关。 |
关键发现
- SaCCO在体内裂解番茄红素、羟基番茄红素和二羟基番茄红素；对照菌株产生1.45 μg番茄红素/5×10^9细胞，诱导表达后降至0.04 μg。（2）纯化的SaCCO体外裂解apo-8'-胡萝卜素醛，产生apo-12'-胡萝卜素醛（m/z
- 10）和apo-10'-胡萝卜素醛（m/z
- 20），表明作用于9'/10'和11'/12'双键；动力学参数Km=122.9±18.5 μM，Vmax=15.9±3.0 nmol·mg-1·min-1，kcat=4.9±0.9 s-1，kcat/Km=39.9±7.0 nM-1·s-1；FeSO4使活性提高约1.5倍。（3）PpCCO裂解玉米黄质、羟基番茄红素等含羟基/酮基的C40及C50类胡萝卜素；全细胞催化鉴定出canthaxanthin、zeaxanthin、nostoxanthin在11'/12'或13'/14'双键切割，astaxanthin仅在13'/14'双键切割，产物包括apo-13'-canthaxanthinone（m/z
- 0）、apo-14'-canthaxanthinal（m/z
- 0）和apo-12'-canthaxanthinal（m/z
- 1）。（4）sala_1008和ppsir1_17230无类胡萝卜素裂解活性。
研究结论
SaCCO和PpCCO是非视网膜形成的类胡萝卜素裂解加氧酶，具有独特的底物特异性和裂解位点选择性，为类胡萝卜素衍生物的微生物生产提供了新工具。