Investigating conservation of the albaflavenone biosynthetic pathway and CYP170 bifunctionality in streptomycetes
- 作者
- Suzy C. Moody, Bin Zhao, Li Lei, David R. Nelson, Jonathan G. L. Mullins, Michael R. Waterman, Steven L. Kelly, David C. Lamb
- 单位
- Institute of Life Science, Medical School, Swansea University, UK; Department of Biochemistry, Vanderbilt University School of Medicine, Nashville, TN, USA; Department of Microbiology, Immunology and Biochemistry, University of Tennessee, Memphis, TN, USA
- 杂志
- The FEBS Journal（2012）
- DOI
- 10.1111/j.1742-4658.2011.08447.x
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
探究 albaflavenone 生物合成途径在链霉菌中的保守性，以及 CYP170 双功能酶（同时具有单加氧酶和萜烯合酶活性）在不同物种中是否保守，并解释 CYP170B1 失去双功能的分子基础。
研究策略
利用 BLAST 搜索预测 CYP170 直系同源蛋白；通过 GC/MS 检测多种链霉菌培养提取物中 albaflavenone 的产生；异源表达、纯化并表征 S. albus 的 CYP170B1；结合分子建模与序列比对，比较 CYP170A1 与 CYP170B1 的结构差异，分析影响 Mg2+ 结合的关键氨基酸。
核心内容
该研究系统考察了链霉菌中albaflavenone生物合成途径的保守性以及CYP170家族双功能酶的进化差异。通过BLAST搜索在10种链霉菌中鉴定到CYP170A1直系同源蛋白，其中与S. lividans同源性高达99%，GC/MS检测证实多种链霉菌均能产生albaflavenone，表明该途径在链霉菌属中高度保守。研究者异源表达并纯化了来自S. albus的CYP170B1，其表达量超过500 nmol CYP/L培养物，纯化蛋白分子量约55 kDa，还原CO差光谱最大吸收在450 nm。功能表征显示CYP170B1仍能催化epi-isozizaene转化为albaflavenone，但仅产生单一albaflavenol中间体，且完全丧失将FPP转化为法尼烯的萜烯合酶活性。分子建模与序列比对揭示，CYP170B1中Mg2+结合关键残基Asp254和Asp257被Gly248和Arg251替代，导致其丧失Mg2+结合能力，从而解释了双功能性的丢失。该研究将CYP170家族划分为双功能的CYP170A亚家族和仅保留单加氧酶功能的CYP170B亚家族，为理解P450酶功能进化提供了结构层面的见解。
创新点
首次系统验证 albaflavenone 生物合成基因簇在多种链霉菌中的功能保守性；将 CYP170 家族分为双功能 CYP170A 亚家族和非双功能 CYP170B 亚家族；通过结构建模阐明 CYP170B1 因 Mg2+ 结合关键残基缺失而丧失法尼烯合酶活性。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces coelicolor A3(2) | albaflavenone 生物合成 | SCO5222 | epi-isozizaene synthase | 催化 | 催化 farnesyl diphosphate (FPP) 环化生成 epi-isozizaene |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | albaflavenone 生物合成 | SCO5223 | CYP170A1 | 催化 | 双功能 P450：催化 epi-isozizaene 氧化为 albaflavenone，并具有法尼烯合酶活性（moonlighting 萜烯合酶活性位点） |
| Streptomyces albus | albaflavenone 生物合成 | CYP170B1 | CYP170B1 | 催化 | 仅具有 albaflavenone 单加氧酶活性，无法尼烯合酶活性；还原 CO 差光谱 450 nm |
| Escherichia coli | P450 电子传递系统 | fldA/flavodoxin, fpr/flavodoxin reductase | flavodoxin, flavodoxin reductase | 能量供给 | 为 CYP170B1 催化 albaflavenone 合成提供还原力 |
关键发现
- BLAST 搜索发现 10 种链霉菌中存在 CYP170A1 直系同源蛋白，其中 S. lividans 同源性 99%，S. viridochromogenes 86%，S. ghanaensis 81%，S. sivecus 80%，S. avermitilis 80%，S. griseoflavus 75%，Streptomyces sp. E14 74%；CYP170B 与 CYP170A1 同源性约 56%。
- GC/MS 证实 S. viridochromogenes、S. avermitilis、S. griseoflavus、S. ghanaensis 和 S. albus 均能产生 albaflavenone（m/z 218）。
- 与分子伴侣 GroES/GroEL 共表达时，CYP170B1 表达量超过 500 nmol CYP/L 培养物（72 h）；纯化蛋白分子量约 55 kDa（预测
- 19 kDa），Soret 峰
- 5 nm，α带
- 5 nm，β带 535 nm，还原 CO 差光谱最大吸收在 450 nm（不同于 CYP170A1 的 440 nm）。
- CYP170B1 能催化 epi-isozizaene 转化为 albaflavenone（保留时间
- 8 min），仅检测到一个 albaflavenol 中间体（保留时间
- 9 min），而 CYP170A1 产生 epimeric 混合物。
- CYP170B1 不能催化 FPP 生成任何 m/z 204 的萜烯产物（包括法尼烯），说明其无萜烯合酶活性；在 pH
- 5 和
- 4 下均无活性。
- 结构建模显示 CYP170B1 的 Mg2+ 结合位点中，CYP170A1 的 Asp254 和 Asp257 被 Gly248 和 Arg251 替代，导致 Mg2+ 结合能力丧失，从而失去法尼烯合酶活性。
研究结论
albaflavenone 生物合成途径在多种链霉菌中高度保守，CYP170A 亚家族成员可能均为双功能酶（兼具 albaflavenone 单加氧酶和法尼烯合酶活性），而 CYP170B 亚家族（如 S. albus CYP170B1）仅保留单加氧酶功能，无法尼烯合酶活性，原因是 Mg2+ 结合关键氨基酸缺失。未来需进一步研究法尼烯的体内合成、生理作用及 CYP170A 双功能性的进化保守性。