An unusual plant triterpene synthase with predominant α-amyrin-producing activity identified by characterizing oxidosqualene cyclases from Malus × domestica
- 作者
- Cyril Brendolise, Yar-Khing Yauk, Ellen D. Eberhard, Mindy Wang, David Chagne, Christelle Andre, David R. Greenwood, Lesley L. Beuning
- 单位
- The New Zealand Institute for Plant and Food Research Limited (Plant & Food Research), Auckland, New Zealand; School of Biological Sciences, University of Auckland, New Zealand
- 杂志
- FEBS Journal（2011）
- DOI
- 10.1111/j.1742-4658.2011.08175.x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
苹果中三萜类化合物（尤其是熊果酸）含量丰富，但负责合成α-香树脂醇（熊果酸前体）的三萜合酶从未被鉴定为专一性酶，且是否存在专一的α-香树脂醇合酶在自然界中尚不明确。本研究旨在从苹果中克隆并表征氧化角鲨烯环化酶（OSC），明确其产物特异性及表达模式。
研究策略
从苹果'Royal Gala'的EST数据库中筛选出三个候选OSC基因，通过本氏烟草瞬时表达和甲醇毕赤酵母异源表达，结合GC、GC-MS、LC-MS分析产物，利用qPCR分析组织表达差异，并构建系统发育树进行进化分析。
核心内容
从苹果‘Royal Gala’的EST数据库中筛选出三个候选氧化角鲨烯环化酶基因MdOSC1、MdOSC2和MdOSC3，分别在本氏烟草瞬时表达和甲醇毕赤酵母异源表达系统中进行功能鉴定。结果显示MdOSC1是一种前所未有的以α-香树脂醇为主要产物的混合型三萜合酶，其α-与β-香树脂醇产物比例约为5:1，α-香树脂醇占总产物80%以上，而MdOSC2在两种表达系统中均未检测到环化产物，推测可能为假基因或丧失了催化活性。MdOSC1与MdOSC3的氨基酸序列相似性超过99%，应属等位基因或近期旁系同源。qPCR分析表明三个基因均在果皮中表达水平最高，比果肉高出约40倍，根和叶中表达量显著降低。LC-MS结果显示α-香树脂醇在除叶片外的所有苹果组织中占主导，而果实果皮中熊果酸含量远高于其他组织，果肉中则未检出。这些结果首次确立了自然界中能以α-香树脂醇为绝对主要产物的专一性三萜合酶的存在，并为苹果果皮中熊果酸的高积累提供了直接的酶学解释。
创新点
首次鉴定出以α-香树脂醇为主要产物（>80%）的三萜合酶MdOSC1，不同于已知的混合型三萜合酶（通常α-香树脂醇比例较低）；同时发现一个无功能/可能为假基因的MdOSC2。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana（本氏烟草） | 三萜生物合成 | MdOSC1 | 氧化角鲨烯环化酶 | 催化 | 瞬时表达验证，产物α-香树脂醇:β-香树脂醇=5:1，α-香树脂醇>80% |
| Pichia methanolica（甲醇毕赤酵母） | 三萜生物合成 | MdOSC1 | 氧化角鲨烯环化酶 | 催化 | 异源表达确认与植物瞬时表达一致，产物为α-香树脂醇和β-香树脂醇，比例5:1 |
| Nicotiana benthamiana（本氏烟草） | 三萜生物合成 | MdOSC2 | 氧化角鲨烯环化酶 | 催化 | 瞬时表达未检测到任何三萜产物 |
| Pichia methanolica（甲醇毕赤酵母） | 三萜生物合成 | MdOSC2 | 氧化角鲨烯环化酶 | 催化 | 酵母表达亦未检测到产物，推测为假基因或活性丧失 |
| Malus × domestica 'Royal Gala'（苹果） | 三萜生物合成 | MdOSC3 | 氧化角鲨烯环化酶 | 催化 | 与MdOSC1氨基酸相似性>99%，未单独做功能表达，推测功能类似 |
关键发现
- MdOSC1为混合型香树脂醇合酶，α-香树脂醇与β-香树脂醇的比例为5:1，α-香树脂醇占总产物的80%以上
- MdOSC2在烟草瞬时表达和酵母表达中均无产物，可能为假基因或表达无活性
- MdOSC1与MdOSC3氨基酸相似性>99%，为等位基因或旁系同源
- qPCR显示MdOSC1、MdOSC2、MdOSC3均在苹果果皮中表达最高，比果肉高40倍，根中分别比果皮低8倍、30倍和5倍，叶中MdOSC1和MdOSC3极低，MdOSC2未检出
- LC-MS分析显示α-香树脂醇在除叶片外的所有组织中占主导，叶片中α/β香树脂醇比例接近1:1
- 熊果酸在果皮中含量远高于其他组织，果肉中未检出
- 系统发育分析表明MdOSC1/3与多功能三萜合酶聚在一起，MdOSC2与β-香树脂醇合酶聚在一起。
研究结论
从苹果中分离了三个OSC基因，其中MdOSC1是一种独特的混合型香树脂醇合酶，具有前所未有的α-香树脂醇偏好性（>80%），可能解释苹果果皮中熊果酸的高含量；MdOSC2可能已进化为无活性形式或产生未被检测的产物；MdOSC3与MdOSC1高度同源，共同承担苹果中α/β-香树脂醇的合成。