In vitro Transient Expression System of Latex C-serum was used for Analysis of Hevein Promoter in Response to Abscisic Acid in Hevea brasiliensis
- 作者
- Xiao-Wen Fei, Xiao-Dong Deng
- 单位
- Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Agricultural Academy for Tropical Crops, Haikou 571101, China; Department of Biochemistry, Hainan Medical College, Haikou 571101, China
- 杂志
- Journal of Integrative Plant Biology（2008）
- DOI
- 10.1111/j.1744-7909.2007.00628.x
- 所属领域
- 植物分子生物学与基因工程
- 关键词
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解决的核心问题
定位巴西橡胶树 hevein(橡胶蛋白)基因启动子中负责乳管(乳汁)特异性表达以及对脱落酸(ABA)应答的关键顺式作用区段，并验证乳汁C-血清体外瞬时表达系统用于启动子功能分析的有效性。
研究策略
采用5'端嵌套缺失法将hevein基因5'上游1241 bp片段截短为-1184、-749、-292、-168和-63至+56等系列片段，与uidA(gus)报告基因融合构建Hev1184、Hev749、Hev292、Hev168和Hev63载体，转入经优化的乳汁C-血清体外反应体系，通过荧光定量检测GUS活性；同时利用基因枪轰击橡胶叶片进行组织化学定位验证。
核心内容
本研究通过5'端嵌套缺失法将巴西橡胶树hevein基因5'上游1241 bp启动子截短为-1184、-749、-292、-168和-63至+56系列片段，与gus报告基因融合后转入优化的乳汁C-血清体外瞬时表达系统，并结合基因枪轰击叶片进行组织化学定位，解析了启动子中负责乳管特异性表达和ABA应答的关键区段。结果显示，含-749~-292区段的Hev749在无ABA条件下GUS活性为592.2 pmol MU·min⁻¹·mg⁻¹ protein，而缺失该区段的Hev292活性降至113.4，表明该区段为乳管特异性表达所必需；0.38 mM ABA诱导下，Hev292活性可达4141.6，而Hev168仅220.9，说明-292~-168区段对ABA诱导至关重要。基因枪轰击验证了Hev749驱动GUS在叶脉乳管中特异表达，而35S启动子仅在叶肉表达。研究同时确立了10,000g离心1h制备C-血清的最佳条件。该工作将hevein启动子的乳管特异性元件定位在-749~-292，ABA应答区段定位在-292~-168，并验证了C-血清体外系统用于橡胶树启动子功能分析的高效性，为该启动子在乳胶中表达重组蛋白的应用奠定了基础。
创新点
['优化并建立了乳汁C-血清体外瞬时表达系统，确定10,000g离心1h为最佳制备条件(橡胶颗粒浓度0.14 g/mL，仍保留转录翻译活性)', '首次将hevein启动子的乳管特异性表达元件(LSE)定位在-749~-292区段', '发现-292~-168区段为ABA诱导表达所必需，提示该区域含非典型ABRE元件']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Hevea brasiliensis (巴西橡胶树) 乳汁C-血清 | 天然橡胶生物合成/乳胶凝固 | hevein基因 (GenBank: AF327518) | Hevein蛋白 | 催化 | 单链丝氨酸蛋白酶，含43氨基酸抗真菌肽，通过结合几丁质使橡胶粒子聚集参与乳胶凝固；在乳汁中积累量比叶片高10倍以上 |
| Hevea brasiliensis 乳汁C-血清 | 启动子活性检测报告系统 | uidA (gus) | β-葡萄糖醛酸酶 (GUS) | 催化 | 报告基因，通过荧光定量(MUG底物)和组织化学染色(X-Gluc底物)检测启动子活性 |
| Hevea brasiliensis | hevein基因转录调控 | hevein启动子 (5'上游-1184~+56) | — | 调控 | -749~-292为乳管特异性表达元件(LSE)；-292~-168为ABA诱导表达关键区段 |
| — | 植物激素信号转导 | — | — | 调控 | 脱落酸(ABA)：0.38 mM为理想诱导浓度，通过-292~-168区段内的非典型ABRE元件调控hevein启动子表达 |
| Hevea brasiliensis 乳汁C-血清 | 体外转录翻译系统 | — | — | 能量供给 | 经10,000g离心1h去除橡胶颗粒，保留细胞核、核糖体、mRNA及可溶性蛋白等转录翻译机器，为外源基因体外表达提供能量与必需组分 |
关键发现
- ['含-749~-292区段的Hev749(无ABA)GUS活性为592.2 pmol MU·min⁻¹·mg⁻¹ protein，Hev1184为566.7，而pBI121仅133.4
- Hev292、Hev168、Hev63的活性分别降至113.4、70.7、58.4，表明-749~-292是乳管特异性表达所必需', '0.38 mM ABA诱导下，Hev1184、Hev749、Hev292的GUS活性分别达6715.3、5968.1、4141.6 pmol MU·min⁻¹·mg⁻¹ protein，而Hev168、Hev63仅220.9和196.1(与pBI101的195.7相当)，说明-292~-168区段对ABA诱导表达至关重要', '0.38 mM ABA为理想诱导浓度
- 9~19 mM浓度下对照本底活性升高', '基因枪轰击橡胶叶片后，Hev749驱动GUS在叶脉(乳管主要分布部位)特异表达，pBI121(CaMV 35S::uidA)只在叶肉细胞表达而不在叶脉，验证了LSE的乳管特异性', 'hevein蛋白在乳汁中的积累量比叶片中高10倍以上', '10,000g离心2h或15,000g离心2h后C-血清中检测不到GUS活性，而10,000g离心1h可保留体外表达活性']
研究结论
hevein基因启动子-749~-292区段包含乳管特异性表达元件(LSE)，-292~-168区段为ABA诱导表达的关键区域(含非典型ABRE)。优化的乳汁C-血清体外瞬时表达系统可快速、有效地分析橡胶树启动子功能，该启动子具有在可提取乳胶中表达工业或医药用重组蛋白的应用潜力。