The gene carD encodes the aldehyde dehydrogenase responsible for neuroproxarxanthin biosynthesis in Fusarium fujikuroi
- 作者
- Violeta Díaz-Sánchez, Alejandro F. Estrada, Danika Trautmann, Salim Al-Babili, Javier Avalos
- 单位
- Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Spain; Faculty of Biology, Albert-Ludwig University of Freiburg, Germany
- 杂志
- FEBS Journal（2011）
- DOI
- 10.1111/j.1742-4658.2011.08242.x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定藤仓赤霉（Fusarium fujikuroi）中催化neurosporaxanthin（β-apo-4'-carotenal酸）生物合成最后一步（β-apo-4'-carotenal的醛基氧化为羧基）的醛脱氢酶基因carD，填补该通路最后未知的酶学步骤。
研究策略
基于粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）YLO-1的序列同源性克隆藤仓赤霉carD；在E. coli中异源表达并纯化粗酶进行体外酶活分析；构建可产生β-apo-4'-carotenal的E. coli菌株，体内验证CarD的催化活性；通过同源重组在carS高类胡萝卜素积累菌株中敲除carD，分析突变体的类胡萝卜素积累表型。
核心内容
本研究鉴定并功能表征了藤仓赤霉中负责神经孢黄素（neurosporaxanthin）生物合成最后一步的醛脱氢酶基因carD。通过序列同源性从粗糙脉孢菌YLO-1克隆获得carD，其编码蛋白含450个残基的ALDH结构域和91个残基的C端延伸，但缺乏跨膜域。体外酶活实验证明CarD可将β-apo-4'-carotenal氧化为neurosporaxanthin，也能转化β-apo-8'-carotenal（C30）、β-apo-10'-carotenal（C27）和apo-8'-lycopenal，但不转化视黄醛（C20）。在大肠杆菌体内共表达CarD可实现β-apo-4'-carotenal向neurosporaxanthin的转化。光照30分钟后carD mRNA水平约增加3倍，而carB约增加100倍。在carS高类胡萝卜素积累菌株中敲除carD后，突变体完全丧失neurosporaxanthin合成能力，积累β-apo-4'-carotenal及其还原产物，红色产物最大吸收波长从474 nm移至482 nm。该基因的鉴定完成了藤仓赤霉neurosporaxanthin全合成通路的酶学解析，并揭示了与粗糙脉孢菌中先氧化后环化不同、先环化后氧化的合成顺序。
创新点
首次鉴定并功能表征了藤仓赤霉中负责neurosporaxanthin生物合成最后一步的醛脱氢酶基因carD；通过体内外实验证明CarD催化β-apo-4'-carotenal氧化为neurosporaxanthin；基因敲除证实其功能，并揭示了与粗糙脉孢菌中不同顺序的神经孢黄素合成途径。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成（neurosporaxanthin pathway） | carD | CarD | 催化 | 醛脱氢酶，催化β-apo-4'-carotenal氧化为neurosporaxanthin |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | carD | CarD | 催化 | 异源表达用于体外酶活和体内转化验证 |
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | carB | CarB | 催化 | 八氢番茄红素脱氢酶，参与脱氢反应，作为表达对照 |
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | carRA | CarRA | 催化 | 双功能酶，具有八氢番茄红素合酶和番茄红素环化酶活性 |
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | carT | CarT | 催化 | 红酵母烯裂解双加氧酶，催化torulene裂解生成β-apo-4'-carotenal |
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | carX | CarX | 催化 | 类胡萝卜素双加氧酶，对称裂解β-胡萝卜素生成视黄醛 |
| Neurospora crassa | 类胡萝卜素生物合成 | ylo-1 | YLO-1 | 催化 | CarD在粗糙脉孢菌中的直系同源物，催化apo-4'-lycopenal氧化为apo-4'-lycopenoic acid |
关键发现
- CarD蛋白包含450个残基的ALDH结构域和91个残基的C端延伸，但缺乏YLO-1中的跨膜域
- 光照30 min后carD mRNA水平约增加3倍，而carB约增加100倍
- 在carS突变体中carD mRNA水平约提高5倍（carB约100倍）
- 体外实验证明CarD可将β-apo-4'-carotenal氧化为neurosporaxanthin，同时也能转化β-apo-8'-carotenal(C30)、β-apo-10'-carotenal(C27)和apo-8'-lycopenal，但不转化视黄醛(C20)
- 在E. coli体内共表达CarD可使β-apo-4'-carotenal转化为neurosporaxanthin
- 敲除carD后（ΔcarD突变体）完全丧失neurosporaxanthin合成能力，积累β-apo-4'-carotenal及其还原产物β-apo-4'-carotenol和少量其他类胡萝卜素，其中红色产物最大吸收波长从474 nm移至482 nm
- ΔcarD突变体中还检测到461 nm吸收的β-apo-4'-carotenol脂肪酸酯类衍生物。
研究结论
CarD是藤仓赤霉中负责neurosporaxanthin生物合成最后一步（β-apo-4'-carotenal氧化）的醛脱氢酶，该基因的鉴定完成了藤仓赤霉neurosporaxanthin全合成通路的酶学解析；与粗糙脉孢菌中先氧化后环化的顺序不同，藤仓赤霉的合成顺序是先环化后氧化。