Exploring diterpene metabolism in non-model species: transcriptome-enabled discovery and functional characterization of labda-7,13E-dienyl diphosphate synthase from Grindelia robusta
- 作者
- Philipp Zerbe, Selina M. Rodriguez, Sibongile Mafu, Angela Chiang, Harpreet K. Sandhu, Mark O'Neil-Johnson, Courtney M. Starks, Jörg Bohlmann
- 单位
- Department of Plant Biology, University of California-Davis; Michael Smith Laboratories, University of British Columbia; Sequoia Sciences
- 杂志
- The Plant Journal（2015）
- DOI
- 10.1111/tpj.12925
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在非模式药用植物Grindelia robusta中，利用转录组资源发现并功能表征参与二萜代谢的关键酶，特别是grindelic acid生物合成途径中催化初始环化反应的labda-7,13E-dienyl diphosphate synthase。
研究策略
基于已发表的G. robusta花组织转录组挖掘二萜合酶候选基因，结合系统发育分析、E. coli异源表达与体外酶活测定（LC-MS/GC-MS/NMR），以及烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时共表达验证酶的功能与组合。
核心内容
该研究以非模式药用植物Grindelia robusta为对象，利用已发表的花组织转录组数据挖掘二萜合酶候选基因，结合系统发育分析、大肠杆菌异源表达、体外酶活测定及本氏烟草瞬时共表达，对grindelic acid生物合成途径中的关键酶进行了功能表征。研究发现，树脂中grindelic acid含量分别比花、叶、茎高9、37和81倍，提示该化合物主要在树脂中积累。通过NMR确证，新鉴定的GrTPS2是单功能的labda-7,13E-dienyl diphosphate synthase，可催化GGPP生成labda-7,13E-dienyl diphosphate，这是grindelane型二萜生物合成的第一步关键反应。此外，GrTPS2在花中的转录水平比叶高6倍，与产物积累模式一致。另一候选酶GrTPS4被鉴定为ent-kaurene synthase。值得注意的是，GrTPS2与已知双功能酶SmCPSKSL1的II类活性位点序列一致性低于50%，表明该单功能酶活性在植物界独立演化；且GrTPS2与I类合酶组合未检测到产物，提示grindelic acid生物合成可能不依赖经典的I类二萜合酶反应。该工作扩展了植物II类二萜合酶的功能多样性，为grindelic acid及其衍生物的生物技术生产奠定了酶学基础。
创新点
首次在被子植物中发现并功能表征单功能的labda-7,13E-dienyl diphosphate synthase（GrTPS2），通过NMR确证了产物结构；揭示了GrTPS2与grindelic acid生物合成的直接关联，扩展了植物II类二萜合酶的功能多样性。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Grindelia robusta（源植物） | 二萜生物合成（grindelane型） | GrTPS2 | labda-7,13E-dienyl diphosphate synthase | 催化 | II类二萜合酶，将GGPP转化为labda-7,13E-dienyl diphosphate，为grindelic acid生物合成的关键酶；NMR验证产物结构。 |
| Grindelia robusta（源植物） | 赤霉素生物合成（通用代谢） | GrTPS4 | ent-kaurene synthase | 催化 | I类二萜合酶，与ZmAN2偶联将ent-CPP转化为ent-kaurene，参与赤霉素合成。 |
| Grindelia robusta（源植物） | 二萜生物合成（labdane型） | GrTPS1 | labda-13-en-8-ol diphosphate synthase (LPP synthase) | 催化 | 此前已表征的II类二萜合酶，催化GGPP生成LPP。 |
| Grindelia robusta（源植物） | 二萜生物合成（manoyl oxide型） | GrTPS6 | manoyl oxide synthase | 催化 | I类二萜合酶，将LPP转化为manoyl oxide，具底物杂泛性。 |
| Grindelia robusta（源植物） | 二萜生物合成（geranyllinalool型） | GrTPS5 | geranyllinalool synthase | 催化 | 此前已表征的I类二萜合酶，催化GGPP生成geranyllinalool。 |
| Escherichia coli BL21(DE3)-C41（异源表达） | 二萜生物合成（ent-CPP生成） | ZmAN2 | ent-copalyl diphosphate synthase | 催化 | 玉米来源的II类二萜合酶，用于与GrTPS4偶联验证ent-kaurene合成，及产物对比。 |
| Nicotiana benthamiana（瞬时表达） | 二萜生物合成 | GrTPS2, GrTPS4, GrTPS6, ZmAN2 | 多种二萜合酶 | 催化 | 农杆菌介导的瞬时共表达验证各酶单独及组合的体内活性；单独表达GrTPS2可生成labda-7,13E-dien-15-ol（内源磷酸酶去磷酸化产物）。 |
| Selaginella moellendorffii（比较物种） | 二萜生物合成（labdane型） | SmCPSKSL1 | bifunctional labda-7,13E-dien-15-ol synthase | 催化 | 双功能I/II类二萜合酶，也能生成labda-7,13E-dienyl diphosphate中间体，但与GrTPS2序列相似性低（活性位点<50%），提示趋同演化。 |
| Grindelia robusta | MEP途径 | — | — | 能量供给 | 二萜前体GGPP来源于质体MEP途径，为二萜生物合成提供通用前体。 |
关键发现
- grindelic acid在树脂中的含量比花、叶、茎分别高9、37、81倍
- GrTPS2催化GGPP生成labda-7,13E-dienyl diphosphate（NMR确证，去磷酸化后为labda-7,13E-dien-15-ol）
- GrTPS4被鉴定为ent-kaurene synthase（与ZmAN2偶联生成ent-kaurene）
- GrTPS2在花中的转录水平比叶高6倍
- GrTPS2与GrTPS1蛋白序列一致性为55%
- GrTPS2与SmCPSKSL1的II类活性位点序列一致性<50%，表明该功能在植物界独立演化
- GrTPS2与GrTPS4或GrTPS6组合未检测到产物，提示grindelic acid生物合成可能缺乏经典的I类二萜合酶反应。
研究结论
GrTPS2是labda-7,13E-dienyl diphosphate synthase，催化grindelane型二萜生物合成的第一个关键步骤，与GrTPS1（LPP合酶）、GrTPS6（manoyl oxide合酶）共同构成G. robusta二萜代谢多样性的酶学基础，为grindelic酸及相关生物制品的生物技术生产提供了途径知识。